Lernzettel: Introduction à la génomique structurale

📋 Plan du Cours

1. Génomique structurale et objectifs
2. Processus et techniques d’analyse
3. Séquençage : principes et limites
4. Méthodes de Maxam et Gilbert
5. Méthode de Sanger et automatisation
6. Séquençage nouvelle génération
7. Pyroséquençage et PCR en émulsion
8. Séquençage Illumina et nanopore
9. Assemblage bioinformatique des lectures
10. Cartographie génomique et marqueurs

📖 1. Génomique structurale et objectifs

🔑 Notions clés & Définitions

• Génomique structurale : Branche de la génomique centrée sur la caractérisation des structures du génome, utiles notamment pour manipuler des gènes et des segments d’ADN.
• Protéomique structurale : Domaine lié à la génomique structurale, focalisé sur la structure tridimensionnelle des protéines produites par un génome.
• Structure tridimensionnelle : Description en 3D des formes des protéines codées par un génome, obtenue via des analyses expérimentales et informatiques.
• Prédiction structurelle traditionnelle : Approche qui vise la structure d’une protéine donnée, à une échelle plus restreinte que la génomique structurale.

📝 Points essentiels

• Pour cloner un gène avec succès, il est important de connaître sa position dans le génome.
• La composition d’un gène aide à comprendre sa fonction et comment il peut être modifié pour des usages pratiques, par exemple la santé.
• La génomique structurale cherche la structure du génome entier en combinant techniques expérimentales et outils informatiques.
• Les données servent à déduire des principes de structure génomique globale à partir de comparaisons entre exemples.
• La méthode vise aussi des propriétés dynamiques comme le repliement des protéines et des cibles pour la découverte de médicaments.

📖 2. Processus et techniques d’analyse

🔑 Notions clés & Définitions

• Carte chromosomique : Représentation qui attribue des gènes et des marqueurs à des chromosomes, puis devient plus détaillée au fil de l’analyse.
• Méthodes de novo : Stratégie où des cadres de lecture ouverts peuvent être clonés et exprimés afin d’obtenir des protéines analysables pour déterminer leur structure.
• Modélisation ab initio : Méthode qui prédit la structure 3D en exploitant des informations de séquence et des interactions entre acides aminés.
• Modélisation basée sur les séquences : Approche utilisant l’homologie entre séquences de protéines pour proposer un modèle de la structure d’une protéine inconnue.
• Threading : Technique qui modélise la structure d’une protéine nouvelle en comparant ses similitudes de repliement et de structure avec une protéine connue.

📝 Points essentiels

• L’analyse commence par l’assignation de gènes et de marqueurs à des chromosomes individuels.
• La résolution finale doit atteindre un niveau suffisant pour séquencer le gène.
• Les méthodes de novo permettent d’obtenir une structure de chaque protéine codée par le génome à partir de protéines purifiées analysées.
• La modélisation ab initio repose sur des informations de séquence et sur les interactions entre acides aminés pour prédire la structure 3D.
• La modélisation basée sur les séquences s’appuie sur l’homologie pour construire un modèle de la protéine inconnue.

📖 3. Séquençage : principes et limites

🔑 Notions clés & Définitions

• Séquençage : Méthode visant à déterminer l’ordre linéaire des composants d’une macromolécule, comme l’ADN ou une protéine.
• Séquençage de l’ADN : Détermination de l’ordre des nucléotides du génome en s’appuyant sur des mécanismes appris depuis la réplication de l’ADN.
• Séquençage des protéines : Détermination de l’ordre linéaire des acides aminés d’une protéine à partir de techniques de séquençage dédiées.
• Erreurs de lecture : Faiblesse du séquençage où des positions nucléotidiques peuvent être mal interprétées lors de la lecture de la séquence.

📝 Points essentiels

• Le séquençage des protéines nécessite un matériel dédié et coûteux, et reste délicat à mettre en œuvre.
• La séquence des protéines peut être déduite à partir de l’ADN.
• Le séquençage de l’ADN est plus simple à mettre en œuvre et très répandu car beaucoup de laboratoires possèdent un petit séquenceur automatique.
• Des erreurs peuvent exister, comme l’omission d’un nucléotide ou l’inversion de l’ordre des nucléotides.
• Pour obtenir une séquence fiable, il faut séquencer plusieurs fois un même fragment.

📖 4. Méthodes de Maxam et Gilbert

🔑 Notions clés & Définitions

• Maxam et Gilbert : Famille de méthodes de séquençage basées sur des propriétés chimiques des nucléotides pour générer des fragments révélateurs de la séquence.
• Marquage en 5’ au phosphore 32 : Procédure où l’ADN à séquencer est marqué en position 5’ avec $^{32}$P (dATP) avant les étapes chimiques de clivage.
• Clivage chimique : Étape de rupture contrôlée de l’ADN, réalisée par des réactifs spécifiques des purines ou des pyrimidines.
• Dimethyl sulfate : Réactif mentionné pour cliver au niveau des purines, en méthylant G et A puis en coupant selon le contexte acide ou alcalin.
• Hydrazine et pipéridine : Ensemble de réactifs utilisés pour attaquer C et T puis pour réaliser une coupure selon la condition chimique.

📝 Points essentiels

• La méthode démarre par un marquage de l’ADN en 5’ avec le phosphore 32 (dATP) avant les clivages.
• L’ADN est clivé après A, G, C ou T grâce à des réactifs chimiques spécifiques.
• Le dimethyl sulfate méthyle G et A, puis un traitement en milieu alcalin coupe au niveau de G selon des conditions acide ou alcalines.
• L’hydrazine attaque C et T puis une pipéridine réalise une coupure, avec un comportement modifié en présence de $NaCl$ 2M pour bloquer la réaction de T.
• Après clivage, les fragments sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et la séquence est lue par autoradiographie.

📖 5. Méthode de Sanger et automatisation

🔑 Notions clés & Définitions

• Fred Sanger : Inventeur associé à une méthode enzymatique de séquençage reposant sur l’incorporation de didésoxynucléotides.
• Didésoxynucléotides ddNTP : Analogues des nucléotides qui stoppent la synthèse car ils ne permettent pas la formation de la liaison phosphodiester après incorporation.
• ddNTP terminateurs de chaîne : Rôle des ddNTP : une fois incorporés, l’élongation s’arrête car la chaîne ne peut plus s’allonger correctement.
• Séquençage automatique : Version automatisée où les ddNTP sont marqués par des fluorochromes et la détection se fait par balayage laser.

📝 Points essentiels

• La méthode de Sanger utilise des didésoxynucléotides dont l’absence de $3’-OH$ empêche la formation de la liaison phosphodiester.
• Quatre réactions sont classiquement menées en parallèle, chacune avec un ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) à faible concentration.
• Le mélange contient ADN polymérase, amorce, dNTP, un ddNTP, et des sels comme $MgCl_2$ pour réaliser l’extension.
• Les fragments sont séparés sur gel de polyacrylamide avec une résolution permettant de distinguer des longueurs séparées d’un seul nucléotide.
• En séquençage automatique, les 4 ddNTP marqués sont en compétition dans un même tube et le résultat s’affiche sous forme de chromatogramme.

📖 6. Séquençage nouvelle génération

🔑 Notions clés & Définitions

• NGS : Ensemble de techniques de séquençage apparues à partir de 2004, capables de générer des millions de séquences via des plateformes automatisées.
• Amplification par PCR : Étape où l’amplification des banques d’ADN matrice repose sur la PCR plutôt que sur la multiplication clonale.
• Emulsion PCR (EmPCR) : PCR utilisée pour amplifier une banque d’ADN où les fragments sont liés à des billes d’agarose analysées en puits optiques.
• PCR par pontage (bridge amplification) : PCR réalisée sur une surface solide pour produire des clusters d’amplicons à partir d’un fragment initial lié à un adaptateur.
• Flow-cell : Surface solide où se font des amplifications et des lectures, notamment en bridge amplification pour former des clusters.

📝 Points essentiels

• Depuis 2004, des techniques NGS industrielles sont commercialisées sur des plateformes automatisées.
• Les nouvelles technologies n’utilisent pas la multiplication clonale : elles amplifient par PCR les banques d’ADN matrice.
• L’EmPCR utilise des billes d’agarose portant chacune un exemplaire d’ADN déposée dans un puits de lame analysable par fibre optique.
• La bridge amplification fixe les fragments via des adaptateurs sur une flow-cell et génère des clusters d’amplicons issus d’un même fragment initial.
• Les NGS reposent sur la synthèse d’ADN, l’hybridation sur puces à ADN, ou des détections en temps réel de molécules, selon les variantes.

📖 7. Pyroséquençage et PCR en émulsion

🔑 Notions clés & Définitions

• Pyroséquençage : Méthode NGS détectant l’incorporation de nucléotides via une cascade produisant un signal lumineux mesurable.
• Picotiter plate : Lame à alvéoles où se déroule la réaction et qui est analysable par fibre optique pour capter le signal.
• PPi : Pyrophosphate inorganique libéré lors de l’incorporation d’un nucléotide complémentaire au brin matrice.
• Chimioluminescence : Production d’un signal lumineux visible déclenchée après la libération de PPi et une cascade enzymatique.
• APS, ATP sulfurylase, luciférase : Chaîne enzymatique où l’APS permet de transformer le PPi en ATP utilisé ensuite par la luciférase pour générer le signal.

📝 Points essentiels

• En EmPCR, la banque matrice est amplifiée en émulsion et chaque bille porte un exemplaire d’ADN dans un alvéole de la picotiter plate.
• Lors du pyroséquençage, les dNTP sont ajoutés en flux successif et l’incorporation d’un nucléotide complémentaire libère du PPi.
• La libération de PPi déclenche une chimioluminescence suivie par une détection optique via une caméra CCD.
• En présence d’APS, l’ATP sulfurylase transforme le PPi en ATP puis la luciférase convertit la luciférine en oxyluciférine pour émettre un signal lumineux.
• La hauteur du pic du pyrogramme est proportionnelle au signal lumineux, donc liée au nombre de nucléotides incorporés au même moment.

📖 8. Séquençage Illumina et nanopore

🔑 Notions clés & Définitions

• Illumina/Solexa : Technologie NGS basée sur une amplification par pontage sur flow-cell et une lecture par mesure de fluorescence lors de cycles de synthèse.
• ddNTP bloquant l’extension : Caractéristique des nucléotides utilisés dans Illumina/Solexa : marqués et modifiés pour bloquer le $3’-OH$ afin d’inhiber l’élongation.
• Genome Analyzer sequencing system : Système de séquençage associé à la technologie Illumina/Solexa mentionnée dans le cours.
• Technologie du nanopore : Méthode NGS où l’ADN simple brin traverse un nanopore et les bases sont identifiées par le courant électrique à travers le pore.
• Hélicase ou ADN polymérase : Enzymes citées comme agents qui amènent l’ADN vers le nanopore en extrudant l’ADN simple brin à vitesse réduite.

📝 Points essentiels

• En bridge amplification Illumina/Solexa, les fragments liés à la surface via adaptateurs sont amplifiés en ponts pour former des clusters.
• À chaque cycle, une polymérase, une amorce et les 4 dNTP sont ajoutés, et chaque dNTP est marqué par un fluorochrome distinct.
• Les dNTP sont modifiés pour bloquer le $3’-OH$, ce qui empêche la poursuite de l’élongation avant la lecture.
• La fluorescence du dernier nucléotide incorporé est mesurée avant une réaction chimique qui enlève le fluorochrome et débloque le $3’-OH$.
• Dans le nanopore, l’ADN est ralenti par constriction et l’identification se fait par mesure de l’intensité du courant électrique à travers le pore.

📖 9. Assemblage bioinformatique des lectures

🔑 Notions clés & Définitions

• Contigs : Assemblages plus grands reconstruits à partir de séquences obtenues en répétition et alignées pour reconstituer des portions continues.
• Comparaison des séquences obtenues : Étape de l’assemblage où plusieurs lectures du même fragment sont comparées pour repérer les chevauchements et l’ordre local.
• Aligner des parties séquencées : Action de faire correspondre les lectures recouvrantes pour ordonner les morceaux et produire des contigs.
• Bioinformatique NGS : Traitement informatique indispensable après la génération des lectures pour reconstruire un génome et corriger les erreurs.

📝 Points essentiels

• L’assemblage compare des séquences obtenues plusieurs fois pour aligner les parties séquencées et reconstituer des contigs.
• Il reste à ordonner et orienter les contigs, et des répétitions peuvent conduire à assembler des régions distantes du chromosome.
• Des trous peuvent apparaître dans l’assemblage et sont comblés par un séquençage ciblé.
• La correction des erreurs nécessite un renouvellement du séquençage pour améliorer la qualité de la séquence.
• La bioinformatique sert à produire une ébauche de génome rapidement, notamment pour la comparer à une espèce proche ou rechercher des motifs/domaines spécifiques.

📖 10. Cartographie génomique et marqueurs

🔑 Notions clés & Définitions

• Cartographie génomique : Représentation d’un génome visant à déterminer l’ordre des marqueurs et les distances (liées au taux de recombinaison).
• Marqueurs : Repères génomiques dont la position relative et l’écart servent à comprendre l’organisation et la recombinaison entre régions.
• Carte physique chromosomique : Carte où la localisation de fragments d’ADN est rattachée à un chromosome ou à une région chromosomique.
• Carte physique moléculaire : Carte basée sur des collections de fragments d’ADN insérés dans des chromosomes artificiels comme les BAC.
• Carte génétique : Carte basée sur la position relative de gènes ou marqueurs séparés par recombinaison méiotique.

📝 Points essentiels

• La cartographie génomique sert à connaître le nombre de gènes impliqués et leurs positions sur les chromosomes.
• Elle permet aussi d’estimer la contribution de chaque gène à la variation globale d’un caractère.
• Trois méthodes sont listées : carte physique chromosomique, carte physique moléculaire et carte génétique.
• La carte génétique s’appuie sur la recombinaison pendant la méiose et la distance génétique $d_{AB}$ correspond au nombre moyen de crossing-overs entre A et B par méiose.
• Les microsatellites sont des séquences répétées (SSR) dont le polymorphisme vient de la variation du nombre d’unités de répétition.

📅 Repères chronologiques

Date	Événement
1980	Prix Nobel de chimie attribué à Gilbert et Sanger pour les techniques de séquençage de la fin du XXe siècle.
fin des années 1970	Mise au point des deux techniques de séquençage (Maxam et Gilbert, Sanger) à la fin des années 1970.
2004	Disponibilité sur le marché de nouvelles techniques de séquençage (NGS) utilisant des plateformes industrielles automatisées.

📊 Tableaux de synthèse

Maxam et Gilbert vs Sanger (principe)

Approche	Principe clé	Type de réaction
Maxam et Gilbert	Clivage chimique pour révéler la séquence	Réactifs chimiques spécifiques nucléotides
Sanger	Arrêt d’élongation avec ddNTP pour révéler la séquence	Synthèse enzymatique avec didésoxynucléotides

⚠️ Pièges & confusions fréquents

1. Confondre le rôle des ddNTP : ils arrêtent l’élongation via l’absence de $3’-OH$, pas via une coupure chimique.
2. Croire que NGS dépend encore de la multiplication clonale : le cours précise que l’amplification passe par PCR.
3. Mélanger les objectifs : la génomique structurale vise la structure à l’échelle du génome et des protéines codées, pas uniquement une protéine unique.
4. Oublier que des erreurs de séquençage existent (omission ou inversion) et qu’une séquence fiable nécessite plusieurs lectures du même fragment.
5. Interpréter mal la cartographie génétique : la distance $d_{AB}$ correspond au nombre moyen de crossing-overs par méiose, pas à une distance physique directe.
6. Penser que les contigs sont finaux : ils doivent encore être ordonnés/orientés et les trous comblés par séquençage ciblé.

✅ Checklist Examen

1. Définir la génomique structurale et expliquer son lien avec la structure 3D des protéines codées.
2. Donner au moins deux objectifs cités de la génomique structurale (fonction, repliement, cibles médicaments, comparaison).
3. Décrire le déroulement général d’analyse : assignation gènes/marqueurs, clarification de la carte chromosomique, puis résolution permettant la séquence.
4. Citer et différencier les techniques d’analyse : méthodes de novo, modélisation ab initio, modélisation basée sur les séquences, threading.
5. Expliquer ce que mesure le séquençage (ordre linéaire) et distinguer séquençage de l’ADN vs séquençage des protéines.
6. Lister des limites du séquençage (erreurs de lecture) et la conséquence pratique pour obtenir une séquence fiable.
7. Expliquer le principe chimique de Maxam et Gilbert : marquage 5’, clivages spécifiques, séparation sur gel et lecture par autoradiographie.
8. Expliquer le principe de Sanger : polymérase, amorce, compétition ddNTP vs dNTP, arrêt d’élongation et séparation gel.
9. Donner les différences majeures du Sanger automatisé : même tube, ddNTP fluorescents, lecture par chromatogramme.
10. Exposer ce qui caractérise les NGS : génération massive de séquences, amplification par PCR, et présence de variantes comme EmPCR et bridge amplification.
11. Décrire le pyroséquençage : flux de dNTP, libération PPi, cascade APS/ATP sulfurylase/luciférase, détection CCD et interprétation des pics.
12. Décrire Illumina/Solexa : clusters sur flow-cell, dNTP fluorés bloquant $3’-OH$, mesure de fluorescence puis retrait fluorophore et poursuite.
13. Décrire le nanopore : enzyme contrôlant la vitesse, passage dans le pore, identification par courant électrique.
14. Expliquer l’assemblage bioinformatique : alignement/chevauchements, construction de contigs, ordonnancement/orientation, trous et correction par séquençage renouvelé.