Hoja de repaso: Thérapie Génique

📋 Plan du Cours

1. Principes et domaines d'application
2. Défis et stratégies de correction génique
3. Vecteurs non viraux de transfert
4. Vecteurs viraux et production lentivirale
5. Exemples en maladies génétiques
6. Thérapies anticancéreuses par gène suicide et suppresseur
7. Édition génique et technologies ciblées
8. Thérapies cellulaires CAR-T et immunothérapie

📖 1. Principes et domaines d'application

🔑 Notions clés & Définitions

• Thérapie génique : Une approche thérapeutique impliquant le transfert d'un ADN ou ARN médicament, visant à l'origine la réparation d'un gène déficient par intégration d'un gène thérapeutique pour restaurer la production d'une protéine absente ou déficiente.

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• Les applications actuelles de la thérapie génique couvrent les maladies génétiques (perte de fonction à compenser), les cancers (gènes suicides, immunothérapie), les maladies virales (production de protéines antivirales, modification des cellules cibles), les maladies acquises (production de protéines à effet thérapeutique) et les vaccins (injection d'ADN/ARN codant pour des antigènes viraux).
• Environ 65 % des thérapies géniques en essais cliniques ciblent le traitement des cancers, dont 20 % de surexpression d'antigènes tumoraux, 20 % de surexpression de cytokines, 10 % d'expression de gènes suppresseurs de tumeurs et 7 % de gènes suicides.

Compléments

• La thérapie génique d'origine correspond à une « gene augmentation » (ajout d'un gène fonctionnel) et non à un remplacement du gène déficient.
• Moins de 10 % des thérapies géniques en essais cliniques concernent le traitement des maladies génétiques héréditaires.

📖 2. Défis et stratégies de correction génique

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• Le défi principal de la thérapie génique est de modifier suffisamment de cellules pour corriger le phénotype pathogène.
• Les stratégies de modification génique incluent le remplacement, la modification (exon skipping), l'inhibition (oligos anti-sens, ribozyme) et la surexpression, ciblant des gènes endogènes ou exogènes.

Compléments

• Les défis secondaires de la thérapie génique incluent le contrôle de la correction (pas trop, pas trop peu), les effets hors-cible (Off Targets) et l'immunogénicité.
• L'efficacité du traitement sur cellules différenciées dépend du nombre de cellules transformées, tandis que sur des cellules souches, quelques cellules modifiées peuvent être à l'origine d'une régénération tissulaire complète.
• La procédure de thérapie génique pour une maladie monogénique comprend l'isolation du gène, son clonage dans un système d'expression adéquat, le choix du vecteur de transfert selon son tropisme et le choix de la procédure d'administration (in vivo ou ex vivo).

📖 3. Vecteurs non viraux de transfert

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• Les vecteurs non viraux comprennent l'ADN nu (plasmide), l'ADN combiné à des moyens physiques (électroporation, gene-gun) et l'ADN combiné à des formulations lipidiques (liposomes).
• Les avantages des vecteurs non viraux sont la sécurité, la reproductibilité, la simplicité et le coût, tandis que leurs inconvénients sont une faible efficacité, une expression transitoire et un ciblage limité.

Compléments

• Les vaccins Pfizer et Moderna utilisent des liposomes comme vecteurs non viraux pour délivrer l'ARNm.

📖 4. Vecteurs viraux et production lentivirale

🔑 Notions clés & Définitions

• Pseudotypage : Consiste à modifier l'enveloppe virale d'un vecteur lentiviral pour modifier son tropisme tissulaire, de manière naturelle ou artificielle.

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• Les vecteurs viraux utilisent les capacités naturelles d'infection des virus et doivent répondre aux contraintes d'innocuité, de neutralisation du risque de réplication et d'immunogénicité.
• La production de vecteurs lentiviraux repose sur la séparation du génome viral en 3 plasmides : un contenant le gène d'intérêt avec les LTR et le signal d'empaquetage, un contenant les gènes gag et pol, et un contenant le gène env modifiable pour le tropisme.

Compléments

• Lors de la production de lentivecteurs, seul l'ARN contenant le gène d'intérêt est empaqueté grâce au signal d'empaquetage, et la transduction de la cellule cible entraîne une transcription inverse et une intégration stables sans réplication virale possible.
• L'immunogénicité du virus utilisé et celle de la nouvelle protéine exprimée constituent une attention particulière lors du transfert du gène d'intérêt dans la cellule cible.

📖 5. Exemples en maladies génétiques

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• L'ADA-SCID est due à une mutation du gène de l'adénosine désaminase, provoquant une accumulation de désoxyadénosine (dATP) qui arrête le cycle cellulaire et entraîne l'absence de lymphocytes B et T.
• La SCID-X1 (« bébés bulles ») est due à une mutation du gène codant la protéine γc, chaîne commune aux récepteurs de l'IL2, IL4, IL7, IL9 et IL15, entraînant l'absence de lymphocytes T et NK et des lymphocytes B inactifs.
• Le protocole SCID-X1 (Cavazzana-Calvo et Fischer, 2000) comprend le prélèvement de cellules souches CD34+, leur transformation par rétrovirus avec le gène γc, la vérification de l'intégration (max 10 % des cellules) et la réinjection, permettant le repeuplement du système immunitaire.
• Le protocole SCID-X1 a été arrêté après l'apparition de leucémies T dans 3 cas sur 16 enfants traités, car l'intégration du transgène à proximité du proto-oncogène LMO2 et la forte activité transcriptionnelle des LTR dérégulaient les gènes voisins.

Compléments

• La première thérapie génique réussie a eu lieu en 1990 aux États-Unis pour l'ADA-SCID, avec une AMM délivrée en 2016 (Strimvelis, GSK/MolMed) au coût de 594 000 euros.
• Le Glybera, première thérapie génique autorisée en Europe en 2012 pour la déficience en lipoprotéine lipase (LPLD), utilisait un vecteur AAV1 injecté dans les muscles et a été arrêté définitivement en 2017 faute de demande, malgré un coût d'un million d'euros par traitement.
• Zolgensma (Novartis) traite l'amyotrophie musculaire spinale (AMS) due au gène SMN1, maladie léthale avant 2 ans, au coût de 2 millions d'euros par traitement.
• La myopathie de Duchenne est plus sévère que celle de Becker car un changement de cadre de lecture crée un codon STOP prématuré déclenchant le NMD, entraînant une absence totale de dystrophine.
• La thérapie de la myopathie de Duchenne utilise l'intégration par AAV d'un oligo antisens provoquant l'exon skipping, ce qui maintient le cadre de lecture et produit une protéine incomplète mais partiellement fonctionnelle, comme dans la maladie de Becker.

📖 6. Thérapies anticancéreuses par gène suicide et suppresseur

🔑 Notions clés & Définitions

• Bystander Effect : Explique la régression tumorale malgré la transfection incomplète des cellules : le ganciclovir phosphorylé est transféré aux cellules voisines via les gap-junctions et l'ingestion de corps apoptotiques, avec un effet à distance par activation du système immunitaire.

📝 Points essentiels

★ À maîtriser

• La thérapie par gène suicide HSV-TK utilise une kinase virale qui phosphoryle le Ganciclovir (prodrogue) en un analogue de dGTP toxique bloquant la réplication, provoquant la mort ou l'arrêt de prolifération des cellules tumorales.

Compléments

• Le Gendicine, première thérapie génique approuvée en Chine en 2003, utilise un adénovirus contenant le gène p53 (Ad-p53) pour réexprimer le gène suppresseur de tumeur p53 et activer le système immunitaire via les cellules NK.

📖 7. Édition génique et technologies ciblées

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPR/Cas9 : (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) est un système d'édition génique permettant l'invalidation de gènes et l'augmentation de l'efficacité de recombinaison homologue, utilisant un motif PAM (NGG) pour la reconnaissance de la séquence cible.
• TALEN : (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) sont des protéines de fusion entre des TAL effectors bactériens, dont les domaines RVD reconnaissent chaque base d'ADN, et l'enzyme FokI, permettant de couper l'ADN génomique avec une précision inférieure à 100 bp.

📝 Points essentiels

• Les solutions futures pour éviter les leucémies liées à l'intégration incluent la diminution de l'activité transcriptionnelle des LTR (Self-inactivating lentivirus), l'utilisation de promoteurs spécifiques à plus faible activité, l'ajout d'isolateurs transcriptionnels et le ciblage de l'intégration par Knock-In.
• L'amylose à transthyrétine (ATTR) héréditaire a été la première maladie testée chez l'homme avec une thérapie génique à base de CRISPR-Cas9 ciblant l'anti-TTR.

📖 8. Thérapies cellulaires CAR-T et immunothérapie

🔑 Notions clés & Définitions

• CAR T cells : (Chimeric Antigen Receptor T cells) combinent la thérapie cellulaire, la thérapie génique, l'immunothérapie et les anticorps, et sont dirigées contre CD19 dans le traitement des leucémies et lymphomes.

📝 Points essentiels

• Les développements futurs des CAR T cells incluent un essai clinique de phase 1 de CAR19 universels modifiés par CRISPR pour les leucémies B réfractaires de l'enfant et la production de CAR T cells in vivo pour traiter les lésions cardiaques (Science, 2023).

⚠️ Pièges & confusions fréquents

1. La thérapie génique classique ajoute un gène fonctionnel sans remplacer le gène muté, contrairement à l'édition génique qui peut corriger la mutation.

✅ Checklist Examen

1. Thérapie génique
2. Pseudotypage
3. Bystander Effect
4. TALEN
5. CAR T cells
6. CRISPR/Cas9
7. Les applications actuelles de la thérapie génique couvrent les maladies génétiques (perte de fonction à compenser), les cancers (gènes suicides
8. Le défi principal de la thérapie génique est de modifier suffisamment de cellules pour corriger le phénotype pathogène.
9. Les vecteurs non viraux comprennent l'ADN nu (plasmide), l'ADN combiné à des moyens physiques (électroporation
10. Les vecteurs viraux utilisent les capacités naturelles d'infection des virus et doivent répondre aux contraintes d'innocuité
11. L'ADA-SCID est due à une mutation du gène de l'adénosine désaminase, provoquant une accumulation de désoxyadénosine (dATP) qui arrête le cycle
12. La thérapie par gène suicide HSV-TK utilise une kinase virale qui phosphoryle le Ganciclovir (prodrogue) en un analogue de dGTP toxique bloquant
13. Environ 65 % des thérapies géniques en essais cliniques ciblent le traitement des cancers, dont 20 % de surexpression d'antigènes tumoraux
14. Les stratégies de modification génique incluent le remplacement, la modification (exon skipping), l'inhibition (oligos anti-sens
15. Les avantages des vecteurs non viraux sont la sécurité, la reproductibilité, la simplicité et le coût
16. La production de vecteurs lentiviraux repose sur la séparation du génome viral en 3 plasmides : un contenant le gène d'intérêt avec les LTR