Hoja de repaso: Mécanismes de la transcription et maturation

📋 Plan du Cours

1. Structure des gènes eucaryotes
2. ARN polymérases et transcription
3. Promoteurs bactériens et initiation
4. Initiation par l’ARN polymérase II
5. Terminaison de la transcription
6. Maturation des ARNm eucaryotes
7. Épissage et protéines SR
8. Couplage transcription-maturation
9. Épissage alternatif
10. Régulation de l’opéron lactose

📖 1. Structure des gènes eucaryotes

🔑 Notions clés & Définitions

• Promoteur eucaryote : Région de l’ADN reconnue par le système de transcription pour démarrer la synthèse de l’ARN.
• Site d’initiation +1 : Point de départ de la transcription correspondant au premier nucléotide présent sur l’ARN synthétisé.
• Terminateur t : Région où la transcription s’arrête, repérée comme site de fin de synthèse de l’ARN.
• Unité de transcription : Segment d’ADN qui contient la séquence transcrite en ARN lors d’un même événement transcriptionnel.
• Exons et introns : Segments de gène eucaryote : les exons participent à la partie conservée de l’ARN, tandis que les introns sont retirés avant l’ARN mature.

📝 Points essentiels

• Chez l’Homme (haploïde), la taille du génome est d’environ $3{,}3\times10^9$ pb avec ~64.000 gènes au total et ~22.000 gènes codants des protéines.
• Chez la Souris (haploïde), la taille du génome est d’environ $3{,}3\times10^9$ pb avec ~39.000 gènes au total et ~22.000 gènes codants des protéines.
• La taille moyenne des exons chez l’Homme et la Souris est ~300 pb, tandis que les introns moyens sont ~7,5 kb (Homme) et ~6 kb (Souris).
• Chez l’Homme, le nombre total d’isoformes protéiques produites par épissage alternatif est ~200.000, soit plus de 95% des gènes ; chez la Souris, c’est ~100.000 avec 63% des gènes.
• Les gènes peuvent être chevauchants, c’est-à-dire localisés de façon partielle sur le même fragment d’ADN, ce qui complexifie l’organisation du codage.

💡 Astuce mémo

Exons = petits morceaux (~300 pb) ; introns = grands “intercalaires” (kb).

📖 2. ARN polymérases et transcription

🔑 Notions clés & Définitions

• ARN polymérase bactérienne : Machine enzymatique d’une bactérie qui synthétise l’ARN à partir d’un ADN double brin, avec un seul type d’enzyme pour la transcription.
• Holoenzyme ARN polymérase : Ensemble actif constitué de l’ARN polymérase core et d’un ou plusieurs facteurs de transcription qui permettent l’assemblage sur le promoteur.
• ARN polymérases eucaryotes : Famille d’enzymes distinctes (pol I, pol II, pol III, et aussi pol IV et pol V chez les végétaux) dont chacune transcrit un type de gène.
• Brin matrice : Brin d’ADN servant de modèle pour la synthèse de l’ARN, lu dans le sens 3’→5’ pendant la transcription.

📝 Points essentiels

• La transcription s’effectue uniquement sur l’ADN double brin, et pour un gène donné un seul brin sert de matrice.
• Le brin matrice est lu dans le sens 3’→5’, tandis que le précurseur ARN est synthétisé dans le sens 5’→3’.
• Chez les bactéries, l’ARN polymérase est une ADN-dépendante avec un core formé par 5 sous-unités (2 α, 1 β, 1 β’, 1 ω).
• Le core se combine avec des facteurs de transcription pour former l’holoenzyme, par exemple avec le facteur σ70 qui reconnaît le promoteur.
• Chez les mammifères, pol I transcrit les ARNr (classe I) avec ~40.000 molécules/cellule, pol II les ARNm (classe II) avec ~40.000 molécules/cellule, et pol III les ARNr 5S + ARNt (classe III) avec ~20.000 molécules/cellule.
• En eucaryotes, les pol I/II/III sont des enzymes à sous-unités nombreuses (pol I 14, pol II 12, pol III 17 sous-unités).

💡 Astuce mémo

Matrice = 3’→5’ (lecture), ARN = 5’→3’ (écriture) : on “lit à l’envers, on écrit à l’endroit”.

📖 3. Promoteurs bactériens et initiation

🔑 Notions clés & Définitions

• Promoteur bactérien : Séquence d’ADN en amont du gène qui sert de site de reconnaissance à l’ARN polymérase bactérienne pour démarrer la transcription.
• Boîte -10 Pribnow : Motif consensus situé vers -10 qui est reconnu par un domaine de la sous-unité sigma s70 au sein du complexe d’initiation.
• Boîte -35 : Motif consensus situé vers -35, reconnu par un autre domaine de la sous-unité sigma s70 pour positionner correctement l’initiation.
• Complexe PIC : Complexe de pré-initiation (PIC) formé quand l’holoenzyme, aidée par la sous-unité sigma, est liée au promoteur avant le début effectif de la synthèse.

📝 Points essentiels

• Chez les bactéries, l’holoenzyme reconnaît successivement les éléments du promoteur situés autour de -35 et de la boîte TATA(-10) avant l’entrée en transcription.
• La sous-unité sigma s70 reconnaît la boîte -10 (Pribnow) via le domaine 2 et la boîte -35 via le domaine 4 au sein du complexe d’initiation.
• Le PIC correspond à une forme « fermée » du complexe avant que l’initiation ne démarre.
• Le début de transcription s’effectue après le passage au complexe « ouvert » sur le promoteur.
• La boîte -10 (Pribnow) a pour séquence 5’ TATAAT 3’ (position -10) et la boîte -35 5’ TTGACA 3’ (position -35).
• Entre boîte -35 et boîte -10, on observe typiquement 15 à 18 pb d’espacement.

💡 Astuce mémo

-35 TTGACA + -10 TATAAT = s70 se cale, PIC (fermé) puis complexe ouvert pour lancer la transcription.

📖 4. Initiation par l’ARN polymérase II

🔑 Notions clés & Définitions

• Complexe de pré-initiation PIC : Le complexe de pré-initiation est l’assemblage ordonné des facteurs généraux et de l’ARN polymérase II au promoteur avant le début effectif de l’élongation.
• TFIID avec TBP : TFIID est un facteur général dont la sous-unité TBP se fixe à la TATA box pour ancrer le promoteur et démarrer l’assemblage du PIC.
• Domaine CTD de pol II : Le domaine CTD de l’ARN polymérase II est une queue dont l’état de phosphorylation commande la transition vers l’élongation et le recrutement de complexes associés.
• Transition early elongation : L’early elongation correspond à l’étape juste après l’initiation, quand l’ARN naissant devient assez long et que la transcription peut faire une pause régulée.

📝 Points essentiels

• TFIID se fixe à la TATA box via sa sous-unité TBP, puis TFIIA et TFIIB aident l’association de TFIID à l’ADN et le recrutement de l’ARN polymérase II.
• Après recrutement de pol II (avec TFIIF), l’addition de TFIIE et TFIIH permet l’ouverture de l’ADN par l’activité hélicase de TFIIH et la phosphorylation du domaine CTD.
• Après synthèse d’un ARN naissant d’environ 10 nucléotides, pol II quitte l’initiation : TFIIB se dissocie alors que TFIID, TFIIA et TFIIH restent liés au promoteur pour une ré-initiation.
• TFIIF reste associé à pol II pour l’élongation au début, limitant les arrêts et réduisant la coupure de l’ARN naissant.
• Quand l’ARN naissant dépasse une dizaine de nucléotides, survient une early elongation avec possibilité de pause promoteur proximal, puis reprise quand les facteurs d’élongation prennent en charge la polymérase.
• Le médiator est un complexe multi-protéique associé à l’extrémité CTD de pol II qui fait le lien entre le promoteur et les régulateurs in vivo.

💡 Astuce mémo

TFIIH = Hélice + Phospho : ouvre l’ADN et phosphoryle la CTD, puis pol II passe de l’initiation vers la suite.

📖 5. Terminaison de la transcription

🔑 Notions clés & Définitions

• Terminaison rho indépendant : La terminaison dépend d’une structure tige-boucle et d’une région riche en U qui provoque une pause puis un décrochage de l’ARN polymérase.
• Terminaison rho dépendant : La terminaison nécessite le facteur Rho qui attache l’ARN puis rattrape la polymérase pour provoquer la dissociation de l’ARN.
• Facteur Rho : Le facteur Rho est une hélicase ATP-dépendante qui se fixe sur un site spécifique de l’ARN appelé rut avant de déclencher la terminaison.
• Signal de polyadénylation PAS : Le PAS est la séquence de la région 3’ qui dirige la polyadénylation et conditionne la terminaison eucaryote via un couplage avec la maturation.
• Modèle torpille : Le modèle torpille propose que la terminaison eucaryote soit facilitée par la dégradation de l’ARN menée par RNase associée après la polyadénylation.

📝 Points essentiels

• La terminaison rho indépendant repose sur une région riche en U qui fragilise les liaisons A-U, entraîne une pause et favorise le décrochage de l’ARN polymérase.
• Les terminateurs rho dépendants possèdent une tige-boucle sans polyU sur l’ARNm.
• Le facteur Rho est une hélicase ATP-dépendante, organisée en hexamère chez E. coli avec 8 sous-unités décrites dans le cours.
• Rho se fixe sur l’ARN au site rut (rho utilization), se déplace en suivant l’ARN polymérase, puis dissocie la polymérase lorsque cette dernière fait une pause.
• En cas de mutant non sens, le ribosome se décroche, ce qui permet à Rho de rattraper l’ARN polymérase prématurément et de provoquer une terminaison anticipée.
• Chez les eucaryotes, il existe un couplage entre polyadénylation et terminaison, décrit notamment par le modèle torpille et un modèle allostérique.

💡 Astuce mémo

Rho = rut puis rattrape : il suit l’ARN pol, profite de la pause et dissocie.

📖 6. Maturation des ARNm eucaryotes

🔑 Notions clés & Définitions

• ARN pré-messager hnRNA : ARN produit par transcription qui doit encore subir capping, épissage des introns et polyadénylation pour devenir un ARNm mature.
• Coiffe 5’ (capping) : Modification de l’extrémité 5’ de l’hnRNA qui se forme dès le début de la transcription et prépare l’ARN à la traduction.
• Spliceosome : Gros complexe ribonucléoprotéique des snRNP (U1, U2, U4, U5, U6) qui reconnaît les bornes d’introns et réalise l’épissage.
• Protéines SR : Famille de protéines riches en sérine et arginine qui activent la reconnaissance des bornes d’introns via des séquences exoniques ESE.
• Signal polyA PAS : Séquence qui spécifie le site de polyadénylation, déclenchant la coupure puis l’ajout de la queue polyA.

📝 Points essentiels

• La coiffe 5’ se forme dès le début de la transcription, protège l’ARN des RNases et facilite la reconnaissance de l’ARN par le ribosome.
• La synthèse de la coiffe 5’ implique la triphosphatase (retrait du phosphate 5’), la guanylyltransférase (ajout du GMP en liaison 5’-5’) puis une méthyltransférase (méthylation de la guanosine et de bases 1 et 2).
• L’épissage des introns spliceosome-dépendants suit des bornes conservées GU (donneur 5’) et AG (accepteur 3’) avec une adénine interne formant un lariat.
• L’épissage par le spliceosome se fait en deux transestérifications successives : formation du lariat puis attaque du 3’OH du premier exon, libération de l’intron et ligation des exons.
• Les protéines SR reconnaissent des séquences ESE sur les exons pour activer la reconnaissance des bornes par U1 et U2AF, contrairement aux séquences ESS reconnues par les hnRNP.
• La polyadénylation se produit avant la fin de la transcription, à proximité d’un PAS (dont la séquence AAUAAA), via un complexe incluant CPSF, CF, CStF et la polyA polymérase (PAP).

💡 Astuce mémo

GU→A(lariat)→AG : bornes GU/AG et adénine interne qui fait le lariat avant ligation des exons.

📖 7. Épissage et protéines SR

🔑 Notions clés & Définitions

• ESE : Les ESE sont des séquences d’exons qui servent de points d’ancrage aux protéines SR pour activer la sélection des bornes d’épissage.
• ESS : Les ESS sont des séquences présentes dans les exons qui recrutent des protéines de type hnRNP pour réprimer la reconnaissance des bornes d’épissage.
• hnRNP : Les hnRNP sont des protéines capables de se fixer sur des séquences inhibitrices comme ESS, ce qui empêche l’épissage.

📝 Points essentiels

• Les bornes d’introns GU et AG sont définies par reconnaissance des exons, car les protéines SR et hnRNP lisent des signaux portés par ces exons plutôt que par une lecture directe de l’intron.
• Les protéines SR possèdent deux régions de liaison : un domaine N-terminal RRM et un domaine C-terminal RS qui permettent à la fois l’interaction avec l’ARN et des interactions protéine–protéine.
• Les ESE activent la sélection d’une borne d’épissage en recrutant des protéines SR, ce qui favorise ensuite la reconnaissance par les snRNP U1 et U2AF et la formation du spliceosome.
• Les ESS agissent à l’inverse en recrutant des protéines hnRNP pour empêcher la reconnaissance de la borne d’épissage correspondante.
• Un choix de borne peut dépendre de la compétition entre activateurs et répresseurs au niveau des séquences (ESE/ESS) contrôlant cette borne.

💡 Astuce mémo

SR = Activeur de Sélection via ESE (et hnRNP via ESS bloque), donc exon “pilote” le GU/AG.

📖 8. Couplage transcription-maturation

🔑 Notions clés & Définitions

• CTD de l’ARN pol II : Le domaine CTD de l’ARN polymérase II sert de plate-forme de recrutement pour les facteurs nécessaires à la maturation des pré-ARNm.
• Recrutement des facteurs de coiffe et polyA : Le complexe de polymérase II recrute au cours de la transcription les facteurs qui ajoutent la coiffe 5’ et clivent puis polyadénylent l’ARN.
• Dégradation NMD : Le NMD est une voie cellulaire qui cible des ARN messagers anormaux après que des facteurs de contrôle sont associés au processus de maturation.

📝 Points essentiels

• La coiffe et la polyadénylation se mettent en place avant la fin de la transcription, ce qui coordonne production et maturation de l’ARNm.
• Le couple transcription-maturation repose sur le recrutement progressif des facteurs de coiffe, d’épissage, puis de polyadénylation à partir de la machinerie de l’ARN pol II.
• Après maturation, l’ARNm mature sort du noyau tandis que l’ARN pol II est relarguée, permettant la suite du cycle de transcription.
• Des facteurs liés au transport et au contrôle de qualité (dont le NMD) s’accrochent à l’ARN en lien avec la transcription et la maturation.
• L’ajout de la polyA protège l’ARNm contre les RNases et favorise la reconnaissance du ribosome pour la traduction.

💡 Astuce mémo

CTD = « Chef d’orchestre » : il recrute CAP puis pA, puis contrôle NMD avant la sortie de l’ARNm.

📖 9. Épissage alternatif

🔑 Notions clés & Définitions

• Intron retenu : Un intron retenu est un intron qui reste dans l’ARN après épissage et contribue donc à la séquence finale comme s’il était un exon.
• Cassette d’exon : Une cassette d’exon désigne un exon présent dans l’ARN seulement dans certains isoformes, car il peut être éliminé avec son intron encadrant.
• Exons mutuellement exclusifs : Des exons mutuellement exclusifs sont choisis par groupes, si bien qu’un exon d’un groupe remplace l’autre dans l’ARN messager mature.
• Borne 3’ alternative : Une borne 3’ alternative correspond à un choix de l’extrémité 3’ d’un intron à enlever, modifiant l’assemblage des exons voisins.
• Site 5’ alternatif : Un site 5’ alternatif correspond à un choix de l’extrémité 5’ d’un intron à enlever, modifiant aussi les exons qui seront conservés dans l’ARN mature.

📝 Points essentiels

• Le promoteur alternatif (choix entre P1 et P2) détermine un site d’initiation de transcription différent, ce qui peut entraîner plusieurs formes d’épissage alternatif.
• Plusieurs cas d’épissage alternatif existent : intron retenu, élimination en cassette, exons mutuellement exclusifs, choix de bornes 3’/5’ multiples selon les conditions, et choix du dernier exon portant le site de polyadénylation.
• Le choix d’une borne d’épissage peut dépendre d’enhancers ou de silencers : ESE/ISE activent la reconnaissance, tandis que ESS/ISS la bloque, avec SR pour activer ESE/ISE et hnRNP pour réprimer ESS/ISS.
• Chaque borne d’épissage fait typiquement l’objet d’une régulation unique, mais un choix peut résulter d’une compétition entre activateurs et répresseurs.
• Dans l’oreille interne des mammifères, l’exon STREX du gène slo apparaît selon l’isoforme: sa présence est associée à une cinétique de désactivation rapide et une faible sensibilité au Ca2+, tandis que son absence donne l’inverse;

📖 10. Régulation de l’opéron lactose

🔑 Notions clés & Définitions

• LacR : Le répresseur LacR est une protéine bactérienne qui empêche la transcription des gènes de l’opéron lac en l’absence d’inducteur.
• Allolactose : L’allolactose est l’inducteur naturel qui se fixe à LacR et déclenche l’activation puis la transcription de l’opéron lac.
• IPTG : L’IPTG est un inducteur synthétique non métabolisable utilisé comme équivalent fonctionnel de l’allolactose.
• Opérateur LacR : Les opérateurs sont des séquences d’ADN où LacR s’assemble pour contrôler l’accès de l’ARN polymérase au promoteur.
• CRP-AMPc : Le complexe CRP-AMPc est un régulateur catabolique qui augmente l’expression de l’opéron lactose quand le glucose est faible.

📝 Points essentiels

• Sans inducteur, LacR permet une activité de base avec une production d’environ 15 molécules de β-galactosidase par cellule et une faible expression.
• Avec inducteur (allolactose), la production de β-galactosidase monte à environ 15.000 molécules par cellule grâce à une induction forte.
• En absence d’inducteur, l’affinité de l’ARN polymérase pour le promoteur augmente d’environ x100 en présence du répresseur, et la dissociation spontanée de LacR dure 2 min 30.
• Quand l’inducteur est présent, LacR se charge en allolactose et l’expression est amplifiée d’environ x1000, avec une augmentation de la transcription.
• Le promoteur est modulé par des motifs à la région -35 (TTTACA au lieu de TTGACA) et une région TATA box modifiée, ce qui contribue au niveau d’initiation de transcription.

💡 Astuce mémo

LacR bloque sans allolactose, allolactose + IPTG lèvent le frein et crient “x1000” : ~15 vs ~15.000 β-gal/cellule.

📅 Repères chronologiques

Date	Événement
11/09	CM1 : 1h30 (23-24) – 11/09
09/09	CM1 : 1h40 (24-25) – 09/09
02/09	CM1 : 1h30 (25-26) – 02/09
14/09	CM3 : 1h30 (23-24) – 14/09

📊 Tableaux de synthèse

Homme vs Souris : génomes et gènes (haploïdes)

Espèce	Génome (pb)	Nb gènes total	Exons / introns (moy.)
Homme	3.300 10^6	~ 64.000	~300 pb / 7,5 kb
Souris	3.300 10^6	~ 39.000	~300 pb / 6 kb

Terminaison bactérienne : rho indépendant vs rho dépendant

Type	Élément clé	Rôle de Rho	Signature
Rho indépendant	Région riche en U	Aucun	Pause puis décrochage (fragilisation A-U, tige-boucle)
Rho dépendant	Site rut	Rho = hélicase ATP-dépendante (hexamère chez E. coli)	Tige-boucle sans polyU sur l’ARNm, Rho rattrape via pause

⚠️ Pièges & confusions fréquents

1. Confondre le brin matrice (lu 3’→5’) et le sens de synthèse de l’ARN (5’→3’).
2. Inverser les bornes d’épissage : GU = donneur 5’ et AG = accepteur 3’, avec adénine interne formant le lariat.
3. Croire que la coiffe 5’ et la polyA sont faites après la transcription ; le cours indique coiffe et polyadénylation avant la fin de transcription.
4. Dire que TFIIH “sert seulement” à l’initiation : il ouvre l’ADN et phosphoryle le CTD pour la transition initiation→élongation.
5. Mélanger terminateur rho-dépendant et rho-indépendant : seul le rho-dépendant nécessite Rho et le site rut.
6. Oublier que les ESE/ESS sont dans les exons (mécanisme de reconnaissance des bornes GU/AG via exons), pas “dans l’intron” directement.
7. Confondre l’effet de l’allolactose/IPTG : ils lèvent la répression de LacR et augmentent fortement la transcription (≈x1000), pas juste x100.

✅ Checklist Examen

1. Savoir définir promoteur, site d’initiation (+1/tss), terminateur (t), unité de transcription, exons et introns.
2. Connaître les règles de transcription : ADN double brin, un seul brin matrice, matrice lue 3’→5’ et ARN synthétisé 5’→3’.
3. Être capable de décrire bactéries vs eucaryotes : 1 ARN polymérase (bactéries) vs pol I/II/III (+ pol IV/V chez végétaux).
4. Donner la structure du core bactérien (5 sous-unités) et expliquer holoenzyme = core + facteurs (ex : sigma s70).
5. Reconnaître les éléments du promoteur bactérien : boîte -35 (TTGACA), boîte -10/Pribnow (TATAAT) et espacement 15 à 18 pb ; étapes PIC fermé→ouvert.
6. Expliquer l’initiation pol II : TFIID/TBP sur TATA, recrutement progressif (TFIIA, TFIIB, pol II/TFIIF, TFIIE, TFIIH) puis rôle hélicase + phosphorylation du CTD.
7. Savoir ce qui déclenche la transition early elongation : après ~10 nt, départ de l’étape d’initiation ; TFIIB dissocié alors que certains restent liés ; rôle du médiator lié au CTD.
8. Comparer terminaison bactérienne : rho indépendant (riche en U, pause puis décrochage) vs rho dépendant (Rho sur rut, rattrape après pause, décrochage).
9. Décrire la maturation de l’hnRNA : capping 5’, splicing (GU/AG, lariat, deux transestérifications, spliceosome snRNP U1/U2/U4/U5/U6), puis polyadénylation via PAS/complexe CPSF/CF/CStF/PAP.
10. Savoir les acteurs de l’épissage : SR (RRM + RS, activateurs via ESE) vs hnRNP (répresseurs via ESS), et compétition activateurs/répresseurs.
11. Enumérer les formes d’épissage alternatif vues : promoteur alternatif, polyA alternatif, intron retenu, cassette d’exon, exons mutuellement exclusifs, bornes 3’/5’ alternatives ; interpréter l’exemple slo (STREX) et/ou élément P (drosophile).
12. Maîtriser la régulation de l’opéron lactose : LacR/allolactose/IPTG, opérateur, effets sur affinité et induction, et répression catabolique par CRP-AMPc (glucose faible).