Lernzettel: Principes et Techniques de la Chromatographie

📋 Plan du Cours

1. Historique et principes fondamentaux de la chromatographie
2. Classification des méthodes chromatographiques selon phases stationnaire et mobile
3. Chromatographie en phase gazeuse : principes, alimentation en gaz vecteur et injection
4. Optimisation des paramètres chromatographiques : facteurs de séparation et coefficient de
5. Types de colonnes en chromatographie gazeuse : colonnes remplies et capillaires
6. Phases stationnaires en chromatographie gazeuse : propriétés et choix
7. Injection en chromatographie gazeuse : modes et caractéristiques des injecteurs
8. Régulation de la température et stabilité du four en chromatographie gazeuse
9. Détecteurs en chromatographie gazeuse : principes, performances et applications
10. Chromatographie liquide haute performance (CLHP) : appareillage, phases stationnaires et
11. Appareillage de la chromatographie liquide haute performance : réservoirs, pompes et injecteurs

📖 1. Historique et principes fondamentaux de la chromatographie

🔑 Notions clés & Définitions

• Applications : Ensemble des usages de la chromatographie mentionnés dans le cours : identification, dosage (quantification) et purification.
• Les chromatographies d’adsorption : Famille de chromatographies où la séparation repose sur l’adsorption sur une phase stationnaire solide, avec notamment la chromatographie liquide-solide, la chromatographie sur colonne et la chromatographie sur couche mince.
• Mikhail Tswett : Botaniste russe associé à la mise en évidence de la chromatographie en 1903.

📝 Points essentiels

• La séparation chromatographique repose sur l’équilibre de concentrations des composés entre une phase stationnaire et une phase mobile en contact.
• Les jalons historiques donnés sont 1903 pour Tswett, 1931 pour la chromatographie sur colonne, 1938 pour la CCM et l’échange d’ions, 1941 pour le concept de chromatographie gaz-liquide, 1955 pour le premier chromatographe gaz-liquide commercial et 1965 pour la CLHP.

💡 À retenir

La séparation chromatographique repose sur l’équilibre de concentrations des composés entre une phase stationnaire et une phase mobile en contact.

📖 2. Classification des méthodes chromatographiques selon phases stationnaire et mobile

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase stationnaire : phase en contact avec la phase mobile, disposée soit dans une colonne, soit sur une surface plane ; elle sert de support au parcours des composés.

• Elution : entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase mobile.

• Principe : équilibre de concentrations des composés entre deux phases en contact, la phase stationnaire et la phase mobile, avec des temps de parcours liés aux propriétés intrinsèques des composés ou à leur affinité pour la phase stationnaire.

• On distingue : les méthodes chromatographiques selon la nature des phases, en particulier selon la forme de la phase stationnaire et selon la nature de la phase mobile.

• Phase mobile : phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant avec elle l’analyte ; elle peut être un liquide ou un gaz.

📝 Points essentiels

• La classification des méthodes chromatographiques dépend de la nature de la phase stationnaire : elle peut se présenter dans une colonne, où la phase mobile progresse au travers, ou sur une surface plane, comme en chromatographie sur couche mince.

• La phase mobile est la phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire et entraîne l’analyte avec elle. Le processus d’entraînement de cet analyte est appelé élution.

• En chromatographie en phase liquide, la phase mobile est un liquide.

• En chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile est un gaz vecteur.

💡 À retenir

Classer les techniques chromatographiques revient à repérer le couple de phases utilisé : nature de la phase stationnaire et nature de la phase mobile. Il faut aussi distinguer le mode de déplacement de la phase mobile, qui entraîne l’analyte par élution.

📖 3. Chromatographie en phase gazeuse : principes, alimentation en gaz vecteur et injection

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’adsorption : Chromatographie en phase gazeuse dans laquelle la phase stationnaire est un solide poreux, réservée à l’analyse de mélanges de gaz ou de liquides à bas points d’ébullition.
• Chambre à vaporisation instantanée : Injecteur situé à une extrémité de la colonne dans lequel l’échantillon est vaporisé avant son entrée dans la colonne.
• Injecteur split/splitless : Injecteur de faible capacité associé à des contraintes de coût, de fragilité, de casse, d’oxydation et de faible capacité.
• Gaz vecteur : Inerte vis-à-vis de l’échantillon et du garnissage de la colonne (phase stationnaire) : He, N2, H2, Ar … (le choix du gaz dépend du détecteur utilisé).

📝 Points essentiels

• En chromatographie en phase gazeuse, l’échantillon est vaporisé puis injecté au sommet de la colonne.
• L’élution est assurée par un flux de gaz inerte appelé gaz vecteur.
• Le gaz vecteur doit être inerte vis-à-vis de l’échantillon et du garnissage de la colonne.
• Le gaz doit être exempt de traces d’H2O et O2, donc pur et desséché.
• L’injection se fait à l’aide d’une microseringue à travers un septum dans une chambre à vaporisation instantanée.

💡 À retenir

En chromatographie en phase gazeuse, l’échantillon est vaporisé puis injecté au sommet de la colonne.

📖 4. Optimisation des paramètres chromatographiques : facteurs de séparation et coefficient de

🔑 Notions clés & Définitions

• Qualitative : Analyse du chromatogramme fondée sur l’identification et la position du pic.
• Temps mort Ve : Temps nécessaire pour que le soluté parcoure le volume mort de la colonne, noté tm dans le chromatogramme.
• K mM CMVM VM K : Coefficient de distribution reliant le facteur de rétention aux masses ou aux volumes de soluté dans les phases stationnaire et mobile, avec k = mS/mM = CSVS/C MVM/VM et k = K.

📝 Points essentiels

• Le coefficient de distribution K est défini par K = CS / CM.
• Le facteur de rétention k est idéalement compris entre 1 et 10 pour les différents solutés d’un mélange.
• Le facteur de sélectivité α est défini par α = k2 / k1.
• Le facteur de résolution R dépend de √N, de k et de α.

💡 À retenir

La performance chromatographique se lit à travers le chromatogramme et dépend du partage du soluté entre phase stationnaire et phase mobile. Le facteur de rétention, la sélectivité et le nombre de plateaux théoriques conditionnent la résolution.

📖 5. Types de colonnes en chromatographie gazeuse : colonnes remplies et capillaires

🔑 Notions clés & Définitions

• CPL préparative : Technique de chromatographie liquide préparative, appelée aussi CLS dans le contenu, fondée sur la chromatographie d’adsorption avec une silice modifiée.
• Colonne remplie : 1ères colonnes en acier, puis en silice fondue (très pure) (FSOT : Fused Silica Open Tubular) recouvert d’une gaine extérieure en polyimide (thermiquement résistant) ø intérieur = 0,1 à 0,35 mm, L
• Pour les colonnes : Contrainte : régulation du débit (u) : débit = 1% tR
• Colonnes remplies : Contrainte : régulation du débit (u) : débit = 1% tR
• Efficacité des colonnes : Comparaison de l’efficacité des colonnes en CPL et CPG : u plus faible en CPL qu’en CPG, H plus petit en CPL qu’en CPG, mais L plus grand en CPG ( 50 m) qu’en CPL (25 à 50 cm max (trop de pertes de charge au-delà)) En général, meilleure efficacité en CPG (N plus grand).

📝 Points essentiels

• Les colonnes capillaires sont des colonnes tubulaires ouvertes où la phase stationnaire tapisse la paroi interne sous forme de film.
• Les colonnes capillaires WCOT ont une grande efficacité, avec environ 200 000 plateaux, contre environ 1 000 pour une colonne remplie.
• Les colonnes capillaires FSOT sont en silice fondue recouverte d’une gaine extérieure en polyimide.
• Colonnes remplies (à garnissage) (les plus anciennes) Tube en acier inox, verre, ou téflon de 1/8 ou 1/4 de pouce de ø (3,18 ou 6,35 mm) et 1 à 3 m de long, rempli d’un support poreux, inerte et stable, finement et uniformément divisé, préalablement recouvert d’une couche mince de la phase stationnaire liquide.
• Colonnes tubulaires ouvertes : la phase stationnaire tapisse les parois internes, sous forme d’un film (épaisseur 0,05 à 5 m) : WCOT (Wall Coated Open Tubular).

💡 À retenir

Les colonnes remplies sont les plus anciennes et utilisent un tube de 1/8 ou 1/4 de pouce de diamètre, de 1 à 3 m de long.

📖 6. Phases stationnaires en chromatographie gazeuse : propriétés et choix

🔑 Notions clés & Définitions

• Mode split : Mode d’injection pour colonnes capillaires dans lequel le gaz vecteur entre avec un débit élevé, une vanne de fuite évacue la plus grande partie du gaz, et seule une faible fraction de l’échantillon, par exemple 1/20 à 1/500, entre dans la colonne.
• Indice de rétention de Kovats : Indice de classement des phases stationnaires, noté I, utilisé avec la référence squalane ; le document définit ΔI comme la différence entre l’indice de la phase et celui du squalane.
• Polysiloxanes : Famille de phases stationnaires capillaires constituées d’une chaîne -Si-O-Si-O- portant des substituants R ; la forme avec R = Me correspond au polydiméthylsiloxane, apolaire, et d’autres substituants peuvent augmenter la polarité.

📝 Points essentiels

• Une phase stationnaire de CPG doit avoir une faible tension de vapeur.
• Une phase stationnaire de CPG doit être thermiquement stable, avec une variation de 1 °C pouvant entraîner une variation de tR de 2 à 3 %.
• Une phase stationnaire de CPG doit être chimiquement inerte.
• Le choix de la phase stationnaire doit permettre d’obtenir des valeurs correctes de k et de α.

💡 À retenir

Le choix de la phase stationnaire en CPG vise d’abord la stabilité, l’inertie et une tension de vapeur faible, tout en donnant des valeurs correctes de k et de α. En colonnes remplies, le classement peut être fait avec l’indice de Kovats et la référence squalane.

📖 7. Injection en chromatographie gazeuse : modes et caractéristiques des injecteurs

🔑 Notions clés & Définitions

• De l’injecteur : Dispositif d’introduction de l’échantillon qui doit permettre la vaporisation tout en évitant la décomposition, avec une température d’environ 50 °C au-dessus du point d’ébullition du constituant le moins volatil.

📝 Points essentiels

• Avec les colonnes capillaires, les quantités injectées sont très faibles et nécessitent un injecteur split/splitless ou équivalent.
• L’injecteur on column réalise une injection directe à froid, à 40 °C, de l’échantillon à l’intérieur de la colonne avec une micro-seringue spéciale.
• L’injecteur on column est adapté aux composés fragiles et thermodégradables, notamment en biochimie.
• Mode splitless : réservé aux solutions très diluées (analyse de traces) Injecteur “on column” : Injection directe, à froid (40°C), de l’échantillon à l’intérieur de la colonne (micro- seringue spéciale).
• Adapté aux composés fragiles (thermodégradables), en biochimie par ex.

💡 À retenir

Avec les colonnes capillaires, les quantités injectées sont très faibles et nécessitent un injecteur split/splitless ou équivalent.

📖 8. Régulation de la température et stabilité du four en chromatographie gazeuse

🔑 Notions clés & Définitions

• Programmation de température : Possibilité de faire varier la température du four de la colonne dans une enceinte thermostatée, avec une plage de fonctionnement de 40 à 400 °C.

📝 Points essentiels

• La colonne est placée dans une enceinte thermostatée pouvant fonctionner de 40 à 400 °C.
• La chromatographie gazeuse peut utiliser une programmation de température du four.
• La stabilité du four doit être très élevée, avec une variation de température de l’ordre de 1 °C.
• Une variation de 1 °C entraîne une variation du temps de rétention de 2 à 3 %.

💡 À retenir

La colonne est placée dans une enceinte thermostatée pouvant fonctionner de 40 à 400 °C.

📖 9. Détecteurs en chromatographie gazeuse : principes, performances et applications

🔑 Notions clés & Définitions

• Principaux détecteurs Performances du détecteur : Ensemble de dispositifs de détection en chromatographie gazeuse dont les performances se jugent par la sensibilité, la réponse linéaire sur plusieurs décades et la sélectivité, avec des détecteurs universels ou sélectifs selon la classe de composés.
• Autres détecteurs - Détecteur thermoionique : Détecteur semblable au FID, muni d’une céramique en silicate de Rb ou Cs à l’extrémité de la flamme, où se forme un plasma générant un grand nombre d’ions en présence de molécules phosphorées ou azotées.
• Sélectif aux composés contenant P et N (applications : Propriété d’un détecteur qui cible les composés phosphorés ou azotés, avec des applications mentionnées pour les pesticides.
• Détecteur à ionisation de flamme (FID) : Détecteur à ionisation de flamme (FID) (le plus utilisé).

📝 Points essentiels

• Le TCD mesure les variations de conductivité thermique du gaz vecteur et reste universel et non destructif.
• Le TCD présente une sensibilité de l’ordre de 10^-8 g/s et une linéarité d’environ 10^5.
• Le FID est le détecteur le plus utilisé, avec une forte sensibilité de l’ordre de 10^-13 g/s et une linéarité de 10^7 à 10^8.
• Le FID est quasi universel mais destructif car il repose sur une combustion.
• Détecteur à conductibilité thermique (TCD) ou catharomètre Mesure des variations de la conductivité thermique du gaz vecteur (H2 ou He) 6 à 10 x > à la plupart des produits organiques Présence de molécules de la conductivité thermique (÷ [ ]) de la T° du détecteur (filament Pt, Au ou W) : système différentiel (pont de Wheatstone)  : simple, linéarité 105, universel, non destructif, colonnes remplies ou capillaires  : sensibilité (10-8 g/s).
•  : forte sensibilité (10-13 g/s), linéarité (107-108), quasi-universel  : destructif (pyrolyse) IV.

💡 À retenir

Le TCD mesure les variations de conductivité thermique du gaz vecteur et reste universel et non destructif.

📖 10. Chromatographie liquide haute performance (CLHP) : appareillage, phases stationnaires et

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase inverse : Mode de chromatographie d’adsorption dans lequel la phase stationnaire est modifiée pour être apolaire; dans ce mode, les composés les plus polaires sont élués en premier.
• Détecteur spectrophotométrique (absorbance) - monochromatique : Source (D ou vapeur de Hg), monochromateur (ex.

📝 Points essentiels

• La CLHP est adaptée aux composés thermosensibles, très polaires, ioniques, peu volatils ou macromoléculaires.
• La CLHP utilise des phases stationnaires de silice modifiée par greffage.
• En chromatographie normale, les composés les plus polaires sont davantage retenus.
• Phase mobile Chromatographie “normale” : Les composés les plus polaires sont davantage retenus Chromatographie “inverse” : Les composés les plus polaires sont élués en premier forts : ammonium (G+ = N(CH3)3+) VI.

💡 À retenir

La CLHP est adaptée aux composés thermosensibles, très polaires, ioniques, peu volatils ou macromoléculaires.

📖 11. Appareillage de la chromatographie liquide haute performance : réservoirs, pompes et injecteurs

🔑 Notions clés & Définitions

• Forts : Groupes fonctionnels anioniques fortement acides portés par une résine échangeuse d’ions, représentés ici par l’acide sulfonique avec G- = SO3-.
• Faibles : Groupes fonctionnels anioniques moins acides portés par une résine échangeuse d’ions, représentés ici par l’acide carboxylique avec G- = COO-.
• Réservoirs de phase mobile : Contenants en verre ou en inox de 0,5 à 2 L destinés à recevoir des solvants très purs, avec filtration pour retenir les poussières et dégazage par barbotage de gaz inerte.
• Pompe à piston alternatif : Système de pompage fournissant une pression pouvant atteindre 420 bars, sans pulsation, avec un débit compris entre 0,1 et 10 mL/min et une précision de l’ordre de 0,5 %, tout en résistant à la corrosion.
• Vanne d’injection à boucle : Dispositif d’injection en CLHP utilisant une boucle de volume compris entre 5 µL et 500 µL pour introduire l’échantillon.

📝 Points essentiels

• La CLHP peut fonctionner en mode isocratique avec un éluant unique ou en mode gradient d’élution avec un mélange de solvants.
• Les réservoirs de phase mobile doivent contenir des solvants très purs et comporter filtration et dégazage.
• La pompe à piston alternatif fournit une pression élevée, jusqu’à 420 bars, sans pulsation.
• L’injection en CLHP se fait par une vanne d’injection à boucle de 5 à 500 µL.

💡 À retenir

La pompe à piston alternatif fournit une pression élevée, jusqu’à 420 bars, sans pulsation.

🧩 Compléments de couverture

1. La chromatographie a été mise en évidence en 1903 par Mikhail Tswett, botaniste russe.
2. La chromatographie sur colonne a été décrite en 1931 par Kuhn et Lederer.
3. La chromatographie sur couche mince a été décrite en 1938 par Izmailov et Scraiber.
4. La chromatographie par échange d’ions est attribuée à Taylor et Urey dans le document.
5. Le concept de chromatographie gaz-liquide est associé à Martin et Synge, Nobel en 1952.
6. Le développement pratique de la chromatographie gaz-liquide date de 1952.
7. Le premier chromatographe gaz-liquide commercial est apparu en 1955.
8. La CLHP est attribuée à Halasz et Horvath en 1965.
9. En chromatographie liquide, la phase stationnaire peut être un liquide immobilisé soit par imprégnation dans un solide poreux, soit par greffage sur le solide.
10. La chromatographie d’exclusion est aussi appelée perméation de gel ou tamisage moléculaire.
11. En chromatographie d’exclusion, les grosses particules sont exclues de la phase fixe tandis que les petites diffusent dans les pores du gel.
12. En chromatographie liquide-solide, la phase stationnaire est un adsorbant solide polaire comme la silice ou l’alumine.
13. La chromatographie d’adsorption en phase inverse correspond à une phase stationnaire modifiée pour devenir apolaire.
14. En CPG, la chromatographie gaz-solide est réservée à l’analyse de mélanges de gaz ou de liquides à bas points d’ébullition.
15. En CPG, les colonnes remplies utilisent souvent un support de terre de diatomées, appelé Chromosorb®, de granulométrie 0,25 à 0,15 mm.
16. Réservoirs de phase mobile (solvants très purs) Verre ou inox (V = 0,5 à 2L) Filtre (poussières), dégazage (barbotage de gaz inerte) - Mode isocratique (éluant unique) - Mode gradient d’élution (mélange de solvants) V.
17. Système de pompage - P = 420 bars - pas de pulsation : pompe à piston alternatif - 0,1 < débit < 10 ml/min ( = 0,5 %) - résistance à la corrosion V.
18. Facteur de résolution On peut montrer que R est ÷ √ N, dépend aussi de k et   = k2 k t’R2 = 1 t’R1 R = 2 tR2 - tR1  + 1 2       III.

📅 Repères chronologiques

Date	Événement
1903	Mise en évidence de la chromatographie par Tswett
1931	Chromatographie sur colonne
1938	Chromatographie sur couche mince et échange d’ions
1941	Concept de chromatographie gaz-liquide
1955	Premier chromatographe gaz-liquide commercial
1965	CLHP

📊 Tableaux de Synthèse

Classification selon les phases

Technique	Phase stationnaire	Phase mobile
Chromatographie liquide	Liquide immobilisé ou solide adsorbant	Liquide
Chromatographie en phase gazeuse	Solide poreux ou phase stationnaire adaptée	Gaz vecteur
Chromatographie sur couche mince	Surface plane	Phase mobile en déplacement sur la surface

Colonnes en chromatographie gazeuse

Type	Structure	Performance
Colonne remplie	Tube en acier, verre ou téflon rempli d’un support poreux	Environ 1 000 plateaux
Colonne capillaire WCOT	Colonne tubulaire ouverte avec film de phase stationnaire sur la paroi	Environ 200 000 plateaux
Colonne capillaire FSOT	Silice fondue avec gaine extérieure en polyimide	Grande efficacité

⚠️ Pièges & Confusions Fréquentes

1. Confondre phase stationnaire et phase mobile : la phase mobile se déplace et entraîne l’analyte, la phase stationnaire reste en place.
2. Oublier qu’en chromatographie en phase gazeuse la phase mobile est un gaz vecteur, alors qu’en chromatographie liquide c’est un liquide.
3. Assimiler chromatographie gaz-solide et chromatographie gaz-liquide : la première repose sur un solide poreux, la seconde sur une phase stationnaire liquide.
4. Confondre colonne remplie et colonne capillaire : la colonne capillaire est tubulaire ouverte, la colonne remplie contient un garnissage.
5. Négliger l’exigence de pureté du gaz vecteur : il doit être inerte et exempt de traces d’H2O et O2.
6. Oublier que la stabilité du four est critique : une variation de 1 °C peut modifier le temps de rétention de 2 à 3 %.

✅ Checklist Examen

1. Définir la chromatographie comme un équilibre de concentrations entre phase stationnaire et phase mobile.
2. Citer les usages : identification, dosage et purification.
3. Distinguer les méthodes selon la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile.
4. Associer 1903 à Tswett et la mise en évidence de la chromatographie.
5. Associer 1931 à la chromatographie sur colonne et 1938 à la CCM.
6. Expliquer le rôle du gaz vecteur en CPG et ses exigences de pureté.
7. Connaître l’intervalle idéal du facteur de rétention k : entre 1 et 10.
8. Savoir que le facteur de sélectivité α vaut k2 / k1.
9. Comparer colonnes remplies et capillaires en termes de structure et d’efficacité.
10. Identifier les modes d’injection split/splitless et on column.
11. Retenir la plage de température du four : 40 à 400 °C.