Hoja de repaso: Évaluation de la Viabilité et Prolifération Cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Culture cellulaire et conditions d’incubation
2. Mesures de la viabilité cellulaire
3. Tests d’exclusion de colorants et colorimétrie
4. Dosages fluorimétriques, luminescence et ATP
5. Mesure de la prolifération cellulaire
6. Mesures de la sénescence cellulaire
7. Mesures de l’apoptose cellulaire

📖 1. Culture cellulaire et conditions d’incubation

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Technique permettant de maintenir des cellules en vie in vitro, de modifier leurs propriétés et d’augmenter leur nombre.
• Incubateur à 37°C : Équipement standard qui maintient les cellules animales à 37°C, avec une atmosphère très humide et une teneur en CO2 contrôlée.
• Culture en suspension : Culture où les cellules ne sont pas attachées à un support et flottent dans le milieu de culture.
• Culture en 3D : Culture où les cellules sont organisées en structure tridimensionnelle, plus proche de l’environnement tissulaire.
• Indice de viabilité : Pourcentage de cellules vivantes dans une population, calculé à partir du nombre de cellules viables et du total.

📝 Points essentiels

• La culture cellulaire sert d’outil pour la biologie cellulaire et moléculaire, pas une finalité en soi.
• Les cellules animales sont généralement incubées à 37°C dans une atmosphère très humide avec une teneur en CO2 contrôlée.
• Les mesures de viabilité et de prolifération sont nécessaires, et la sénescence ou l’apoptose peuvent aussi être évaluées.
• L’indice de viabilité se calcule par (nb de cellules viables / nb de cellules total) × 100.
• La viabilité reflète des fonctions métaboliques actives, comme activité enzymatique, perméabilité membranaire, adhésion, production d’ATP, production de NADPH et absorption de nutriments.
• Les tests de viabilité incluent l’exclusion de colorant, la colorimétrie, la fluorescence, la luminescence et la cytométrie en flux.

💡 Astuce mémo

Incubateur = 37°C + CO2 + humidité : “3C” pour faire vivre les cellules.

📖 2. Mesures de la viabilité cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• MTT : Test au sel de tétrazolium utilisé pour estimer la viabilité via une conversion oxydoréductase en produit coloré.
• Formazan : Produit de réduction du tétrazolium formant des cristaux dont la quantité reflète l’activité métabolique des cellules vivantes.
• XTT : Sel de tétrazolium converti par des enzymes en formazan soluble, mesuré par absorbance pour évaluer la viabilité.
• LDH : Enzyme libérée dans le milieu quand la membrane plasmique se désorganise, utilisée comme marqueur de cytotoxicité.
• SRB : Colorant qui se fixe aux protéines des cellules fixées, permettant d’estimer la viabilité surtout pour les cellules adhérentes.

📝 Points essentiels

• Le MTT (jaune) est réduit par des act d’oxydoréductase en formazan (violet) qui forme des cristaux.
• Le formazan issu du MTT n’est pas soluble dans le milieu, donc il faut une étape de solubilisation (isopropanol acidifié, DMSO, DMF ou SDS).
• La viabilité au MTT se lit par mesure de la DO à 570 nm, et une coloration persistante indique des cellules vivantes.
• Procédure MTT : cellules en plaque 96 puits, exposition à la molécule testée, incubation 72 h, puis lecture de l’absorbance.
• Limite MTT : l’absence de preuve formelle empêche d’exclure une prolifération cellulaire pendant l’essai.
• XTT : le sel de tétrazolium est converti par act de déshydrogénase en formazan soluble, détectable directement dans le milieu de culture (DO 490 et 650 nm).

💡 Astuce mémo

MTT = violet cristaux après solubilisation ; XTT = violet soluble direct.

📖 3. Tests d’exclusion de colorants et colorimétrie

🔑 Notions clés & Définitions

• Exclusion de colorants : Principe selon lequel un colorant ne pénètre que dans les cellules dont la membrane est endommagée, ce qui permet de distinguer viables et mortes.
• Dosage par luminescence : Méthode qui quantifie une lumière produite par une réaction enzymatique, et relie l’intensité mesurée à la présence d’un constituant cellulaire.
• Dosage de l’ATP : Test de viabilité basé sur la mesure de l’ATP via une réaction catalysée par la luciférase produisant une luminescence.
• Cytométrie en flux : Technique qui analyse des cellules en suspension en les faisant passer dans un faisceau lumineux et en mesurant leurs signaux optiques.
• Iodure de propidium : Colorant qui ne pénètre que dans les cellules dont la membrane est endommagée, puis s’accumule dans l’ADN.

📝 Points essentiels

• Les cellules viables gardent leur intégrité membranaire et excluent le colorant, alors que les cellules mortes ne l’excluent pas.
• Le dosage par luminescence mesure la quantité de photons émise lors d’une réaction enzymatique, proportionnelle à un constituant lié à la viabilité.
• Pour l’ATP, l’ATP des cellules viables sert de substrat à une réaction catalysée par la luciférase avec un substrat (oxyférine) pour produire la lumière.
• Le protocole ATP décrit : traiter les cellules avec l’agent d’intérêt, perméabiliser pour libérer l’ATP, ajouter un inhibiteur des ATPases, puis ajouter luciférase et mesurer la luminescence.
• La relation entre signal et quantité cellulaire est établie par des cellules à différentes concentrations donnant des droites parallèles (corrélation signal → lumière).
• En cytométrie en flux, les cellules en suspension passent dans une source lumineuse et modifient la lumière (réfraction) ; les cellules mortes sont plus petites et plus granuleuses que les vivantes selon les signaux mesu

💡 Astuce mémo

Exclusion = membrane intacte = colorant dehors ; Luminescence = ATP → luciférase → photons ; Flux = cellules en file → signaux optiques.

📖 4. Dosages fluorimétriques, luminescence et ATP

🔑 Notions clés & Définitions

• Cycle cellulaire : Ensemble des étapes qui prépare la cellule à se diviser puis à produire deux cellules filles.
• Interphase : Phase du cycle cellulaire où la cellule grandit et réplique son ADN avant la division.
• Mitose : Phase du cycle cellulaire qui sépare le matériel génétique et forme deux cellules filles.
• G0 : État de repos du cycle cellulaire où les cellules divisent rarement.
• Thymidine tritiée [3H]-TdR : Thymidine radiomarquée au tritium utilisée pour suivre l’incorporation pendant la phase S.

📝 Points essentiels

• La progression du cycle se fait en interphase (G1, S, G2) puis en phase M (mitose).
• La mitose comprend Prophase, Prométaphase, Métaphase, Anaphase et Télophase.
• Les cellules en G0 sont au repos ou divisent très rarement.
• Avec [3H]-TdR, la thymidine radiomarquée est ajoutée en excès puis l’ADN est extrait pour mesurer la radioactivité liée à l’incorporation pendant la phase S.
• Avec la BrdU, l’incorporation se fait dans l’ADN en cours de synthèse et la détection repose sur des anticorps anti-BrdU (anticorps primaire puis secondaire).
• Avantages de la BrdU : utilisable in vitro et in vivo, ADN récupérable, marquages possibles en multiplexage, méthode non radioactive.

💡 Astuce mémo

S comme Synthèse : [3H]-TdR et BrdU s’incorporent pendant la phase S.

📖 5. Mesure de la prolifération cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• CFSE : Marqueur fluorescent qui se fixe aux protéines cytoplasmiques, permettant de suivre les divisions cellulaires par cytométrie en flux.
• Cytométrie en flux : Technique qui mesure la fluorescence ou la coloration de cellules individuelles, utile pour détecter la prolifération et la sénescence.
• Bleu de Trypan : Colorant de viabilité utilisé pour distinguer cellules vivantes et mortes lors d’un comptage cellulaire.
• Sénescence cellulaire : État d’arrêt de la prolifération où les cellules ne se divisent plus mais maintiennent une activité métabolique.
• SA-β-gal : Test de détection de l’activité β-galactosidase associée à la sénescence, réalisé à pH acide et révélant des cellules sénescentes bleues.

📝 Points essentiels

• Les cellules qui ne prolifèrent pas gardent une coloration constante, tandis que celles qui prolifèrent montrent une baisse de coloration au fil des divisions.
• Avec la cytométrie en flux, la prolifération peut être estimée en comptant le nombre de divisions subies par la cellule.
• La CFSE se lie notamment aux lysines des protéines cytoplasmiques, et sa dilution au cours des divisions sert de lecture de prolifération.
• Les mesures indirectes de prolifération reposent sur la viabilité cellulaire, par exemple comptage avec/sans bleu de Trypan.
• Le comptage et les tests d’activité enzymatique posent un problème d’interprétation : augmentation du signal peut venir d’un nombre de cellules plus élevé ou d’une mortalité plus faible, et l’activité peut augmenter avec
• La sénescence correspond à un arrêt de la division cellulaire tout en conservant une activité métabolique, ce qui la distingue d’une simple mort cellulaire.

💡 Astuce mémo

CFSE = « dilution = divisions » ; SA-β-gal = « bleu à pH acide = sénescence ».

📖 6. Mesures de la sénescence cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• ELISA sandwich : Méthode immunoenzymatique sandwich qui mesure quantitativement des protéines comme p16 ou p21 dans des lysats ou des cellules fixées.
• Cytométrie en flux : Technique de quantification par cellule qui permet d’analyser la distribution de signaux de p16 ou p21 par fluorescence.
• Immunofluorescence : Approche immunologique semi-quantitative qui visualise la localisation nucléaire versus cytoplasmique et l’intensité relative de p16 ou p21.
• Immunohistochimie : Méthode sur coupes de tissus fixés en paraffine qui évalue p16 ou p21 via un scoring plutôt qu’une concentration absolue.
• Phénotype sécrétoire SASP : Ensemble des changements associés à la sénescence, caractérisés notamment par la sécrétion de cytokines comme IL-6 et IL-8.

📝 Points essentiels

• p16 et p21 peuvent être mesurées par ELISA sandwich dans des lysats ou des cellules fixées.
• La cytométrie en flux quantifie par cellule et permet d’étudier la distribution de p16 (vert) ou p21 (rouge).
• L’immunofluorescence et l’immunoCytoChimie sont semi-quantitatives et renseignent sur la localisation nucléaire versus cytoplasmique et l’intensité relative.
• L’immunohistochimie en tissus fixés en paraffine utilise un scoring basé sur le pourcentage de cellules positives et l’intensité, pas une concentration absolue.
• Le SASP se quantifie notamment par IL-6 et IL-8 mesurées dans les surnageants de culture (sécrétion) ou dans des lysats cellulaires.
• ELISA (mono ou multiplex) offre une haute sensibilité et un haut débit pour des protéines sécrétées comme IL-6/IL-8.

💡 Astuce mémo

p16/p21 : ELISA = quantité, Cytométrie = distribution, IF/IHC = localisation + scoring ; SASP = IL-6/IL-8.

📖 7. Mesures de l’apoptose cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Annexine V : Protéine de détection de l’apoptose qui se fixe à la phosphatidylsérine exposée à la surface de la membrane plasmique.
• Iodure de propidium : Intercalant de l’ADN qui pénètre dans les cellules dont la membrane est devenue perméable, révélant une perte d’intégrité.
• Cytométrie en flux : Technique de mesure qui analyse simultanément plusieurs marqueurs fluorescents sur de nombreuses cellules.
• Caspase 3 : Caspase effectrice principalement impliquée dans l’exécution de l’apoptose, notamment via le clivage de substrats.
• CAD : DNase activée pendant l’apoptose qui dégrade l’ADN génomique après libération de son activité.

📝 Points essentiels

• La phosphatidylsérine est normalement dans le feuillet interne de la membrane plasmique, puis elle est transloquée vers le feuillet externe lors de l’apoptose.
• Le double marquage Annexine V / iodure de propidium permet de distinguer des stades : précoce Annexine V+ ; tardif Annexine V+ / IP+ ; débris nucléaires IP+ ; viables sans marquage.
• L’activation des caspases peut être mise en évidence par Western Blot avec un anticorps dirigé contre les caspases, en comparant une condition d’apoptose à un contrôle positif.
• La caspase 3 peut être suivie par un substrat fluorescent : si les caspases sont actives, elles clivent le substrat et la fluorescence augmente.
• La DNase CAD est naturellement inactive car liée à un inhibiteur (ICAD) ; l’apoptose libère l’activité de CAD en inhibant l’inhibiteur.
• La dégradation de l’ADN en apoptose ne donne pas un “smear” continu mais une échelle de fragments (ladder) correspondant à une fragmentation organisée.

💡 Astuce mémo

Annexine V = “V” pour “Vers l’extérieur” (PS exposée) ; IP = “I” pour “Intégrité perdue” (membrane perméable).

📊 Tableaux de synthèse

Tests de viabilité : principe et lecture

Test	Principe	Lecture
MTT	MTT (jaune) réduit par oxydoréductases en formazan (violet) formant des cristaux	DO à 570 nm après solubilisation du formazan
XTT	XTT converti par déshydrogénases en formazan soluble	DO 490 et 650 nm (rose vers orange)
LDH	LDH libérée dans le milieu quand la membrane plasmique se désorganise	Mesure de LDH dans le surnageant (quantité de LDH)
SRB	SRB se fixe aux protéines des cellules fixées (tuées par TCA) ; moins de fixation si cellules vivantes restent accrochées	DO à 510 nm après récupération du surnageant
Bleu de Trypan	Le bleu est éjecté par mécanisme énergie dépendant ; s’il rentre, la cellule devient bleue	Comptage cellules vivantes (éjectent) vs mortes (bleues)

Marqueurs cytométrie : viabilité vs apoptose

Marquage	Cellules	Interprétation
FDA / IP	FDA vert ; IP rouge	Viables : vert ; mortes : rouge
Annexine V / iodure de propidium	Annexine V détecte PS exposée ; IP détecte perte d’intégrité	Précoce : Annexine V+ ; Tardive : Annexine V+/IP+ ; Débris : IP+ ; Viables : sans marquage

⚠️ Pièges & confusions fréquents

1. Confondre viabilité et prolifération : un signal de métabolisme peut augmenter si la mortalité diminue, sans hausse réelle du nombre de divisions.
2. Croire que MTT est directement mesurable : le formazan est non soluble, il faut une étape de solubilisation avant lecture à 570 nm.
3. Interpréter un test de prolifération indirecte comme une mesure directe : comptage/viabilité ne dit pas combien de fois les cellules se sont divisées.
4. Mélanger les colorants d’exclusion : bleu de Trypan (cellules mortes bleues) vs iodure de propidium (IP pénètre seulement si membrane perméable).
5. Se tromper sur les stades Annexine V/IP : Annexine V+ seul correspond à un stade précoce, Annexine V+/IP+ à un stade tardif.
6. Penser que la dégradation de l’ADN en apoptose fait un “smear” continu : le cours décrit une échelle de fragments (ladder).
7. Confondre sénescence et mort cellulaire : la sénescence est un arrêt de division avec activité métabolique conservée, pas une simple disparition des cellules.

✅ Checklist Examen

1. Définir la culture cellulaire et expliquer pourquoi elle nécessite des conditions d’incubation (37°C, humidité, CO2 contrôlé) et des mesures de viabilité/prolifération.
2. Calculer l’indice de viabilité et rappeler sa formule (cellules viables / cellules totales × 100).
3. Lister les fonctions cellulaires reflétées par la viabilité (activité enzymatique, perméabilité, adhésion, ATP, NADPH, absorption des nutriments).
4. Expliquer le principe général des tests d’exclusion de colorants et distinguer cellules viables vs mortes selon l’intégrité membranaire.
5. Décrire le test au bleu de Trypan : principe d’éjection énergie-dépendante, cellules vivantes vs mortes, et le ratio 1:1 avec bleu 0,2% puis dépôt 20 µL.
6. Comparer MTT et XTT : nature du sel de tétrazolium, produit (formazan) et différence clé de solubilité, puis paramètres de lecture (DO 570 nm vs 490/650 nm).
7. Expliquer LDH et SRB comme tests de viabilité : LDH mesurée dans le milieu quand la membrane se désorganise, SRB réservé aux cellules adhérentes fixées et lecture à 510 nm.
8. Décrire les dosages fluorimétriques : résazurine (bleu→resorufine rose, DO 550/630) et diacétate de fluorescéine (FDA, vert si enzymes estérases actives).
9. Décrire les dosages par luminescence : principe ATP-luciférase/oxyférine, étapes (agent d’intérêt, perméabilisation, inhibiteur ATPases, luciférase) et corrélation signal→quantité cellulaire.
10. Expliquer la cytométrie en flux pour la viabilité et la prolifération : cellules en suspension, signaux optiques, et interprétation FDA/IP (vert vs rouge).
11. Expliquer la prolifération via analogues de nucléosides : [3H]-TdR en phase S (incorporation puis extraction ADN) et BrdU (détection par anticorps anti-BrdU, avantages et limites).
12. Expliquer la prolifération via colorants cytoplasmiques : CFSE se lie aux protéines (lysines) et se dilue avec chaque division, et distinguer des mesures indirectes basées sur viabilité.
13. Définir la sénescence cellulaire (arrêt de division + activité métabolique) et rappeler ses marqueurs (SA-β-gal à pH acide, p16/p21, foyers de dommages ADN, SASP IL-6/IL-8).
14. Décrire les méthodes de mesure de la sénescence : SA-β-gal (X-gal, cellules bleues), p16/p21 (ELISA sandwich, cytométrie en flux, immunofluorescence/immunoCytoChimie, immunohistochimie avec scoring), et SASP (IL-6/IL-8).