Hoja de repaso: Thrombopénies constitutionnelles et modèles murins

📋 Plan du Cours

1. Formation et différenciation des mégacaryocytes en plaquettes avec marqueurs spécifiques
2. Régulation de la mégacaryopoïèse par cytokines, facteurs de croissance et facteurs de transcription
3. Modèles murins transgéniques et mutagenèse aléatoire pour l’étude des thrombopénies constitutionnelles
4. Définition, classification et diagnostic des thrombopénies constitutionnelles héréditaires
5. Mutations génétiques impliquées dans les thrombopénies constitutionnelles et leurs modèles murins associés
6. Syndrome de MYH9 : physiopathologie, manifestations cliniques et modèles murins
7. Thrombopénies par anomalies du cytosquelette : gènes impliqués, transmission et conséquences fonctionnelles

📖 1. Formation et différenciation des mégacaryocytes en plaquettes avec marqueurs spécifiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Marqueurs de différenciation : Des protéines spécifiques exprimées à la surface des mégacaryocytes qui permettent d'identifier leur stade de maturation, telles que CD41 (GPIIb), CD42 (complexe GPIb) et CD61 (GPIIIa).
• Avec un anticorps dirigé contre : L'utilisation d'un anticorps spécifique conçu pour reconnaître et se lier à un antigène particulier présent sur une cellule ou une molécule afin de permettre sa détection.
• Perméabilisées puis immuo-marquées avec : Un procédé où les cellules sont traitées pour rendre leur membrane perméable, permettant ainsi aux anticorps d'accéder aux antigènes intracellulaires lors de l'immunomarquage.

📝 Points essentiels

• La formation de proplaquettes s'effectue à partir de mégacaryocytes obtenus en culture via la différenciation de cellules CD34+ humaines.
• Les mégacaryocytes expriment des marqueurs spécifiques de différenciation : CD41 (GPIIb), CD42 (complexe GPIb) et CD61 (GPIIIa).
• Le complexe GPIIb-GPIIIa, formé par CD41 et CD61, est un récepteur du fibrinogène essentiel à la fonction plaquettaire.
• 2011
• Macro thrombopénie
• Diminution du complexe GP1b-IX-a la surface des plaquettes
• La thrombopénie résulte d’une clairance rapide des plaquettes et d’une production plaquettaire inefficace Fyb/SLP130 DIAPH1 - Autosomique dominant - Macroplaquette - Le diagnostic doit être évoqué devant une diminution d’expression du complexe GPIIb/IIIa à la surface plaquettaire associée à une fixation spontanée et anormale du fibrinogène et de l’anticorps PAC1 (reflet de l’activation du complexe).

💡 À retenir

La différenciation des mégacaryocytes en plaquettes est caractérisée par l'expression progressive de marqueurs spécifiques, permettant d'identifier chaque étape clé de leur maturation et d'évaluer les anomalies de formation.

📖 2. Régulation de la mégacaryopoïèse par cytokines, facteurs de croissance et facteurs de transcription

🔑 Notions clés & Définitions

• Récepteur MPL : Un récepteur homodimérique de la famille des récepteurs de cytokines de type 1, exprimé sur les mégacaryocytes, plaquettes, cellules souches hématopoïétiques et cellules endothéliales, qui médie la signalisation de la thrombopoïétine.
• Facteurs de transcription : Des protéines régulant l'expression génique nécessaire à la différenciation mégacaryocytaire, incluant notamment les familles GATA, ETS (FLI1, ETV6), ainsi que GFI1B et Runx1.
• Facteurs de croissance : Des cytokines modulant la prolifération et la maturation des progéniteurs mégacaryocytaires, telles que la thrombopoïétine, IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF et SCF.
• Formation des plaquettes : Régulation de la formation des plaquettes 2.
• Hormone de croissance :
  • exprimé par les MKs et les plaquettes, les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteurs précoces et les cellules endothéliales La TPO
  • appartient à la famille de cytokines qui comprend l’EPO, le G-CSF, l’hormone de croissance et le Leukemia Inhibitory Factor (LIF).

📝 Points essentiels

• La thrombopoïétine (TPO) est la cytokine principale stimulant la mégacaryopoïèse, agissant via le récepteur MPL à tous les stades.
• La TPO favorise la formation de colonies, la polyploïdisation, la maturation, et l'expression des marqueurs spécifiques, en synergie avec d'autres cytokines.
• • principale cytokine stimulant la mégacaryopoïèse • agit via le récepteur MPL, dont la signalisation aboutit à la modulation de l’expression des gènes impliqués en différents points du processus de différenciation/maturation mégacaryocytaire • Agit à tous les stades de la mégacaryopoïèse ❑ Favorise la formation de colonies de mégacaryocytes à partir de cellules CD34+, leur polyploïdisation, leur maturation cytoplasmique et l’expression de marqueurs de surface spécifiques ❑ Agit en synergie avec d’autres cytokines essentiellement avec l’IL3, le SCF, l’IL11, l’IL6 pour stimuler la différenciation des progéniteurs et augmenter la taille des colonies ❑ Rôle central dans le contrôle de la survie et de la prolifération des CSH Autres régulateurs de la mégacaryopoïèse -Parmi les cytokines, on peut citer -celles qui stimulent la prolifération des progéniteurs : IL-3 et le GM-CSF -celles régulant la maturation terminale tels que l’IL-6, l’IL-11 et LIF -Le SCF joue également un rôle important dans la mégacaryopoïèse.
• Les facteurs de transcription régulant la mégacaryopoïèse Songdej N, Rao K 2017
• La famille GATA
• La famille ETS (FLI1, ETV6).

💡 À retenir

La régulation de la mégacaryopoïèse repose sur la cytokine TPO et les facteurs de transcription, essentiels pour la production contrôlée de plaquettes.

📖 3. Modèles murins transgéniques et mutagenèse aléatoire pour l’étude des thrombopénies constitutionnelles

🔑 Notions clés & Définitions

• Criblage phénotypique systématique : Une méthode d'examen exhaustive des caractéristiques observables, comme le compte plaquettaire, utilisée pour détecter des anomalies chez des souris mutées.
• Séquençage ADN à haut débit : Une technique permettant de déterminer rapidement et en grande quantité la séquence d'ADN afin d'identifier les mutations responsables des phénotypes observés.
• Défaut : Une anomalie qualitative ou quantitative, telle qu'une thrombopathie ou une thrombopénie, résultant d'une mutation génétique affectant la fonction ou le nombre des plaquettes.

📝 Points essentiels

• La mutagenèse chimique aléatoire par ENU induit des mutations spontanées ou provoquées chez la souris.
• Le séquençage ADN à haut débit est utilisé pour identifier les mutations responsables des phénotypes observés.

💡 À retenir

Les outils génétiques murins, tels que la mutagenèse aléatoire, le criblage phénotypique et le séquençage haut débit, permettent de modéliser et comprendre les thrombopénies héréditaires.

📖 4. Définition, classification et diagnostic des thrombopénies constitutionnelles héréditaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Thrombopénie constitutionnelle : Une maladie rare caractérisée par une diminution du nombre de plaquettes sanguines due à des anomalies héréditaires de leur production.
• Corps de Döhle : Des inclusions cytoplasmiques observées dans les polynucléaires, dont la présence oriente vers un diagnostic de thrombopénie héréditaire.
• Origine génétique : La cause des thrombopénies constitutionnelles, qui sont des maladies rares résultant de mutations héréditaires, souvent suspectées après exclusion d'une cause acquise.
• Taille plaquettes Savoia A Clin : Une classification des thrombopénies basée sur la taille des plaquettes : macroplaquettes (>8 μm), taille normale (4-8 μm), et petites plaquettes (<4 μm).

📝 Points essentiels

• La thrombopénie est définie par un nombre de plaquettes inférieur à 150 Giga/L, avec une gravité sévère en dessous de 30 G/L.
• La transmission peut être autosomique dominante, récessive ou liée à l’X, avec les formes récessives souvent associées à la consanguinité.
• Les formes à transmission autosomique récessive sont très souvent liées à un contexte de consanguinité.

💡 À retenir

La thrombopénie est définie par un nombre de plaquettes inférieur à 150 Giga/L, avec une gravité sévère en dessous de 30 G/L.

📖 5. Mutations génétiques impliquées dans les thrombopénies constitutionnelles et leurs modèles murins associés

🔑 Notions clés & Définitions

• RUNX1 ( : Facteur de transcription appartenant au complexe Core Binding Factor, régulant l'expression de gènes spécifiques à l'hématopoïèse et impliqué dans une thrombopénie familiale avec prédisposition aux leucémies aiguës.
• Murins de thrombopénies constitutionnelles : Souris génétiquement modifiées utilisées comme modèles expérimentaux pour étudier les thrombopénies héréditaires humaines, permettant de reproduire ou d'analyser les mécanismes pathologiques associés.
• Myélogramme : Examen cytologique de la moelle osseuse permettant d'évaluer la présence, la maturation et la morphologie des cellules hématopoïétiques, notamment les mégacaryocytes dans le contexte des thrombopénies.

📝 Points essentiels

• Les souris modèles NBEAL2 knock-out reproduisent la macrothrombopénie et l'absence de granules alpha observées chez les patients humains atteints du syndrome des plaquettes grises.
• Les modèles murins Ankrd26 knock-out ne présentent pas de thrombopénie, suggérant que l'haploinsuffisance ne suffit pas à expliquer la pathologie humaine.
• ➢La thrombopénie Paris-Trousseau (TCPT, OMIM 188025) et le syndrome de Jacobsen (JBS, OMIM 147791) - Gène impliqué: FLI1, facteur de transcription de la famille ETS qui coopère avec RUNX1 durant la mégacaryopoïèse - Délétion en 11q23.3, région comportant le gène FLI1 (2004, Ralsova et al) - Mutations ponctuelles (décrites en 2013,2015, 2017) - Autosomique dominante - Thrombopénie légère à modérée, macroplaquettes, dysfonction plaquettaire, granule α géants et défaut de granules δ -Dans le cas du TCPT/JBS, la thrombopénie peut être associée à un retard mental, un retard de croissance, des anomalies cardiaques, des malformations des doigts et de la face.

💡 À retenir

L'étude des mutations génétiques spécifiques et de leurs modèles murins associés permet de relier les phénotypes cliniques aux mécanismes pathogéniques des thrombopénies constitutionnelles.

📖 6. Syndrome de MYH9 : physiopathologie, manifestations cliniques et modèles murins

🔑 Notions clés & Définitions

• Myosine IIA non musculaire : Protéine motrice contractile du cytosquelette présente dans les plaquettes, codée par le gène MYH9, jouant un rôle essentiel dans la forme et la fonction des plaquettes.
• Modèles de souris : Souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les mécanismes des maladies humaines, notamment par inactivation ou modification ciblée de gènes spécifiques.
• Maladies liées au MYH9 : Ensemble de pathologies causées par des mutations du gène MYH9, caractérisées par des anomalies plaquettaires et des manifestations extra-hématologiques telles que surdité, cataracte et néphropathie.

📝 Points essentiels

• Le syndrome de MYH9 est causé par des mutations du gène MYH9 codant la chaîne lourde de la myosine IIA non musculaire, essentielle au cytosquelette plaquettaire.
• Les patients présentent macroplaquettes, corps de Döhle dans les leucocytes et manifestations extra-hématologiques (surdité, cataracte, néphropathie).
• Les souris KO homozygotes MYH9 sont embryonaires létales, tandis que les hétérozygotes sont viables sans macrothrombopénie.
• Les souris KO conditionnelles dans la lignée mégacaryocytaire (PF4-Cre) développent thrombopénie, plaquettes géantes et mortalité des mégacaryocytes.
• La myosine IIA joue un rôle clé dans la migration, cytocinèse et maintien de la forme cellulaire des plaquettes.
• Quin Wang et all., PNAS, 1995 Ex souris Fli-1 -/- : létal - Mort embryonnaire au stade E11,5 à la suite d’hémorragies intracrâniales - Modèle a permis de démontrer la responsabilité de cette protéine dans ces syndromes par l’activation de gènes mégacaryocytaires - Défaut de vasculogenèse et de mégacaryopoïèse Hart et al., 2000 Modèles murins de thrombopénies constitutionnelles : Les souris knock-out conditionnel - permettent l’inactivation du gène dans un tissu donné ou à un moment donné grâce à l’utilisation d’enzymes de recombinaison de l’ADN (Cre-recombinase) exprimée sous contrôle d’un promoteur donné
• Souris dans laquelle un gène sera inactivé de façon tissu spécifique et sera exprimé normalement dans les autres cellules
• Principe: – La Cre recombinase excise l’ADN entre 2 séquences LoxP Souris knock-out conditionnel Cre-Lox Souris knock-out conditionnel Cre-Lox
• Souris dans laquelle un gène sera inactivé de façon tissu spécifique et sera exprimé normalement dans les autres cellules Souris Cre Souris floxée Souris knock-out conditionnel Cre-Lox ❑ Pf4-Cre Modèle développé par le groupe de Skoda (Tiedt et al., Blood 2007) pour obtenir une délétion spécifique de la lignée megacaryocytaire.
• ETS 1 112 198 281 361 452 Y343CN331Tfs*4 R324W R337Q R337W R340C/H Souris Fli-1 -/- : létal Hart et al., 2000 Souris Fli-1 -/+ - Aucun phénotype anormal, ce qui pose la question des mécanismes par lesquels l’haplo- insuffisance chez les patients entraine les divers symptômes Souris exprimant un forme tronquée, dépourvue du domaine c-ter - Homozygote ont une viabilité diminuée de 30% - Thrombopénie et défaut fonctionnels - Défaut d’expression des gènes MKs : Mpl, Itga2b, Gp5, Gp9, Pf4, Nf-e2, Rab27b… Thrombopénie constitutionnelle liée à GATA1 - Gène impliqué: GATA1, facteur de transcription qui contrôle l’expression de gènes impliqués dans MKpoiese ainsi que des gènes impliqués dans la lignée érythroïde.

💡 À retenir

Le syndrome de MYH9 est causé par des mutations du gène MYH9 codant la chaîne lourde de la myosine IIA non musculaire, essentielle au cytosquelette plaquettaire.

📖 7. Thrombopénies par anomalies du cytosquelette : gènes impliqués, transmission et conséquences fonctionnelles

🔑 Notions clés & Définitions

• Régulation du cytosquelette : La régulation du cytosquelette correspond aux mécanismes contrôlant l’organisation et la dynamique des filaments d’actine et des microtubules, essentiels à la formation et à la morphologie des plaquettes.
• Tropomyosine 4 Anomalies : Les anomalies de la Tropomyosine 4, codée par TPM4, incluent des mutations mono-alléliques responsables de macrothrombopénies par altération de l’affinité à l’actine.
• Gènes impliqués : Ng AP et al., PNAS 2014 Défaut de la phase précoce de la MKpoièse ➢Thrombopenie par amégacaryopoïèse et synsostose radio-ulnaire (RUSAT) - Gènes impliqués: HOXA11, MECOM - Autosomique dominant - Risque hémorragique majeur - Risque d’évolution en aplasie médullaire - Thrombopénie majeure des la naissance associée à une fusion proximale des radius et cubistus - Myélogramme: absence ou rare MKs MECOM : Phénotype hématologique plus sévère Thrombopénie néonatale 5-89 G/L Sévère anémie néonatale 2,7 et 4 g/dl Synostose bilatérale + anomalie des doigts fente palatine, dysarthrie (difficulté élocution) Surdité (otite chronique médiane) Modèles murins Hoxa11-/- ont été développés mais n’ont pas permis l’étude des mécanismes impliqués dans la formation des plaquettes, malformation des membres mais pas de thrombopénie.

📝 Points essentiels

• Les thrombopénies liées au cytosquelette résultent de mutations dans DIAPH1, TPM4 et PRKACG, affectant l’organisation de l’actine et de la tubuline.
• Ces mutations entraînent souvent une macrothrombopénie caractérisée par une augmentation du volume plaquettaire moyen.
• La transmission est majoritairement autosomique dominante, à l’exception de PRKACG qui suit un mode autosomique récessif.
• Les modèles murins ont permis de démontrer l’impact de ces mutations sur la formation des proplaquettes et la fonction plaquettaire.

💡 À retenir

Les thrombopénies liées au cytosquelette résultent de mutations dans DIAPH1, TPM4 et PRKACG, affectant l’organisation de l’actine et de la tubuline.

📅 Repères chronologiques

Date	Événement
2011	Macro thrombopénie
2017	Mutations FLI1
2004	Délétion FLI1
2013	Mutations FLI1
2015	Mutations FLI1
1995	Mutations RUNX1

📊 Tableaux de Synthèse

Mutations génétiques et modèles murins en thrombopénies

Gène	Type de mutation	Phénotype murin	Caractéristiques principales
RUNX1	Mutations diverses	Thrombopénie familiale, prédisposition leucémies	Dysfonction hématopoïétique, anomalies mégacaryocytaires
FLI1	Délétion, mutations ponctuelles	Thrombopénie légère à modérée, macroplaquettes	Dysfonction plaquettaire, anomalies morphologiques
TPM4	Mutations mono-alléliques	Macrothrombopénie	Altération de l’affinité à l’actine
HOXA11, MECOM	Mutations diverses	Thrombopénie majeure	Risques hémorragiques, anomalies squelettiques

⚠️ Pièges & Confusions Fréquentes

1. Confusion entre thrombopénies constitutionnelles et acquises
2. Erreur dans l'interprétation des mutations génétiques
3. Confusion entre mode de transmission autosomique dominante et récessive
4. Mésinterprétation des modèles murins comme étant totalement représentatifs des phénotypes humains
5. Confusion entre macrothrombopénie et thrombopénie sévère
6. Erreur dans la classification des tailles plaquettaires
7. Confusion entre mutations affectant la formation de proplaquettes et celles affectant la fonction plaquettaire

✅ Checklist Examen

1. Revoir la classification des thrombopénies constitutionnelles
2. Étudier les marqueurs spécifiques des mégacaryocytes
3. Comprendre le rôle de la thrombopoïétine et du récepteur MPL
4. Maîtriser les modèles murins pour les thrombopénies
5. Différencier les mutations génétiques impliquées dans les syndromes spécifiques
6. Identifier les caractéristiques cliniques des thrombopénies liées au cytosquelette
7. Connaître la transmission génétique des thrombopénies
8. Savoir diagnostiquer une thrombopénie constitutionnelle