Lernzettel: Introduction au clonage moléculaire

📋 Plan du Cours

Définitions et principes du clonage moléculaire et ADN recombinant
Caractéristiques et exemples des vecteurs de clonage plasmidiques traditionnels
Construction et criblage des banques génomiques
Purification des ARNm et synthèse d’ADNc pour banques d’ADNc
Insertion des ADNc dans vecteurs et méthodes de criblage associées
Organisation et répétitions dans le génome humain et implications pour le clonage
Types de vecteurs adaptés à la taille des inserts et taille des banques génomiques
Principes et protocoles d’amplification par PCR pour clonage
Paramètres et conception des amorces pour amplification PCR
Composition du milieu réactionnel et déroulement du protocole PCR
Autres domaines d’application de la PCR et techniques associées
Production de protéines recombinantes

📖 1. Définitions et principes du clonage moléculaire et ADN recombinant

🔑 Notions clés & Définitions

ADN recombinant : Une molécule d’ADN construite en laboratoire à partir de matériel génétique provenant de sources multiples.

📝 Points essentiels

L’insert correspond à l’ADN exogène intégré dans un vecteur.
L’ADN recombinant est une molécule d’ADN construite en laboratoire à partir de matériel génétique provenant de sources multiples.
Vecteur 42 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 43 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Préparation de bactéries compétentes Souches de E. coli non pathogènes, incapables de se développer dans l’intestin humain (pas de risque pour l’expérimentateur) : E. coli K12 et souches dérivées (DH5α, DH10B) 44 Stockage des bactéries en présence de glycérol cryoprotecteur. I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Préparation de bactéries compétentes en accord avec la méthode de transformation Bactéries E. coli compétentes : bactéries capables de capter facilement de l’ADN présent dans leur environnement. 45 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Transformation des bactéries chimiquement compétentes par choc thermique Choc thermique très court 46 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Transformation par électroporation 47 Transformation par électroporation Puis le plasmide avec une origine de réplication relâchée se réplique → plusieurs copies du plasmide/ cellule bactérienne I - Construction
Molécules éliminées par lavages I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Chromatographie d’affinité, principe général Solution contenant la molécule d’intérêt purifiée Tampon adapté à l’accrochag e Solution adaptée à l’élution 32 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Chromatographie d’affinité → Purification d’une molécule en 3 étapes 1 - Accrochage, adsorption De la molécule d’intérêt (phase mobile, soluble) est accrochée sur une matrice inerte (phase stationnaire, insoluble) Forte affinité entre la molécule à purifier et la matrice 2 - Lavages Elimination des molécules qui n’ont pas d’affinité pour la matrice 3 - Elution Modifications des conditions → la molécule d’intérêt n’a plus d’affinité pour la matrice, elle est éluée Obtention de la molécule d’intérêt en solution dans un tampon 50°C → l’agarose fond L’ADN emprisonné dans l’agarose passe en solution Conditions d’élution : Faible concentration en sels 7 < pH < 8,5 33 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Principe de la purification d’un fragment d’ADN par chromatographie d’affinité sur silice = matrice insoluble Conditions de l’accrochage de l’ADN sur la silice : Forte concentration en sels, pH < 7,5 34 Purification d’ADN par chromatographie sur mini colonne de silice Ligation Transformation Sélection Colonie bactérienne Vecteur 42 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 43 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Préparation de bactéries compétentes Souches de E.

💡 À retenir

Le clonage moléculaire repose sur la construction d’ADN recombinant, où un insert est inséré dans un vecteur capable de se répliquer, permettant la manipulation et la propagation de l’ADN exogène en laboratoire.

📖 2. Caractéristiques et exemples des vecteurs de clonage plasmidiques traditionnels

🔑 Notions clés & Définitions

Multisite de clonage (MCS) : Une région du vecteur plasmidique contenant plusieurs sites de restriction différents, permettant l’insertion flexible de fragments d’ADN.
Clonage Traditionnel Exemples de vecteurs : Des vecteurs plasmidiques classiques tels que pBR322 et Bluescript SK, caractérisés par une petite taille, une origine de réplication relâchée, un gène de résistance à un antibiotique, et un multisite de clonage.

📝 Points essentiels

Le plasmide pBR322 est un des premiers vecteurs de clonage largement utilisés.
Les promoteurs T7, T3 et SP6 présents de part et d’autre du MCS permettent la transcription in vitro d’ARN sens ou antisens.
La sélection sur milieu LB agar contient ampicilline, X-Gal et IPTG pour différencier les clones recombinants par la couleur des colonies.
Vecteur 23 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 24 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilise des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert 5 étapes : ➢ Préparation de l’ADN : digestion(s), modification(s) puis purification de l’insert et du vecteur (vérification, dosage) A définir en fonction de la stratégie de clonage utilisée ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction 25 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Propriétés minimales d’un vecteur de clonage : ➢ Molécule qui se réplique, possède une origine de réplication autonome et relâchée → amplification et préparation faciles de l’ADN du vecteur ➢ Molécule d’ADN suffisamment petite (~ 3kpb) pour être facilement manipulable et pouvoir intégrer une séquence d’ADN exogène suffisamment grande ➢ Multisite de clonage (MCS), région qui contient des sites de restriction uniques → intégration d’une séquence d’ADN exogène ➢ Gène de résistance à un antibiotique → Sélection des plasmides recombinants I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilisation d’enzymes de restriction pour découper l’
ADNc 3 - 1 - Définitions De nombreux vecteurs recombinants disponibles proviennent de la construction de banques. Deux types de banques ont été construites : ➢ Banque génomique : collection de vecteurs recombinants, dans chaque vecteur a été intégré un morceau de l’ADN génomique d’un organisme donné. Toutes les séquences du génome de l’organisme sont représentées dans la banque. ➢ Banque d’ADNc : collection de vecteurs recombinants, dans chaque vecteur a été intégré un ADN complémentaire (ADNc) ou un morceau d’ADNc, d’un ARNm exprimé dans le type cellulaire ou le tissu de départ. Tous les ADNc du tissu de départ sont représentés dans la banque. 77 ADN génomique purifié 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc Parallèle avec les 5 étapes d’un clonage traditionnel ➢ Digestion(s), modification(s) puis purification de l’ insert et du vecteur ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction → criblage 78 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage par hybridation moléculaire 1/ préparation d’une sonde nucléotidique marquée 2/ hybridation moléculaire 3/ Révélation de la sonde Révélation et superposition avec la boîte de départ Sonde marquée Sonde nucléotidique marquée présentant une certaine homologie de séquence avec la séquence d’intérêt ou ADNc … Répété X fois (X= nombre de boîtes nécessaires pour étaler la banque) X est fonction de la taille du génome de l’organisme et de la taille des inserts 3 clones contiennent une séquence apparentée à la sonde utilisée Hybridation de la sonde avec les membranes 3 – Construction de banques génomiques ou d’

💡 À retenir

Les vecteurs plasmidiques classiques, comme pBR322 et Bluescript SK, possèdent un multisite de clonage, une origine de réplication relâchée, un gène de résistance, et intègrent des éléments fonctionnels facilitant la sélection et la manipulation d’ADN recombinant.

📖 3. Construction et criblage des banques génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

ADNc : Type d'ADN synthétisé à partir de l'ARN messager (ARNm) par transcription inverse, utilisé pour construire des banques d’ADNc, qui sont accessibles à la communauté scientifique.
Construction de banques génomiques : Procédé consistant à insérer des fragments d’ADN génomique dans des vecteurs (ex : BAC, cosmid, plasmide P1, YAC) pour créer une collection représentative du génome, en utilisant des vecteurs adaptés à la taille des inserts.

📝 Points essentiels

La taille de la banque génomique dépend de la taille du génome et de la taille des inserts, avec un calcul précis du nombre de clones nécessaires pour une couverture de 99% selon la formule N = ln(1-P)/ln(1-f).
Les vecteurs BAC permettent de cloner de grands fragments d’ADN, limitant la taille maximale à environ 2000 kb, facilitant la construction de banques génomiques pour des organismes à génome volumineux.
Le nombre de clones requis pour couvrir un génome est inversement proportionnel à la taille des inserts, et la couverture est assurée par un nombre suffisant de clones, généralement 500 par filtre.

💡 À retenir

La taille de la banque génomique dépend de la taille du génome et de la taille des inserts, avec un calcul précis du nombre de clones nécessaires pour une couverture de 99% selon la formule N = ln(1-P)/ln(1-f).

📖 4. Purification des ARNm et synthèse d’ADNc pour banques d’ADNc

🔑 Notions clés & Définitions

ADNc : Molécule d’ADN synthétisée par transcription inverse à partir d’ARNm, représentant les séquences codantes exprimées dans un tissu ou une cellule.
Première Etape : Purification des ARNm à partir d’un extrait total d’ARN par chromatographie sur colonne utilisant des oligodT couplés à une matrice insoluble ou à des billes magnétiques.
Chromatographie sur oligo dT : Technique de purification des ARNm basée sur leur fixation spécifique à une matrice insoluble ou des billes magnétiques couplées à des oligodT, qui se lient à la queue polyA des ARNm.
Reverse transcriptase : Enzyme ARN-dépendante qui synthétise l’ADNc à partir des ARNm en utilisant des amorces oligo(dT) ou des amorces aléatoires, avec des variantes comme la reverse transcriptase Superscript dépourvue d’activité RNAse H pour produire des ADNc plus longs.

📝 Points essentiels

La reverse transcriptase Superscript (Invitrogen) sans activité RNAse H permet la synthèse d’ADNc plus longs, suivie d’un traitement RNAse H pour éliminer l’ARN.
Une banque d’ADNc contient des ADN complémentaires des ARNm exprimés dans un tissu donné, donc plus petite qu’une banque génomique.

💡 À retenir

Maîtriser les étapes clés de purification des ARNm par chromatographie sur oligodT et de synthèse d’ADNc avec la reverse transcriptase permet de construire une banque d’ADNc représentative de l’expression génique.

📖 5. Insertion des ADNc dans vecteurs et méthodes de criblage associées

🔑 Notions clés & Définitions

Banque d’ADNc : Collection de colonies bactériennes contenant des vecteurs recombinants dans lesquels des ADNc issus d’ARNm ont été insérés, permettant la conservation et le criblage de ces séquences.
Dans un vecteur : Insertion d’un fragment d’ADN, tel qu’un ADNc, dans un plasmide ou autre vecteur de clonage, permettant la création d’un clone recombinant.
Banques génomiques ou d’ ADNc : Collections de vecteurs recombinants contenant respectivement des fragments d’ADN génomique ou des ADNc, utilisées pour le criblage et l’étude génétique.
Clonage d’ADNc : PCR 101 Applications : clonage d’ADNc quantifier un ARN (vu en ETG) Trois types d’amorçage pour la reverse transcription sont possibles :
- Amorce spécifique d’un ARNm, ADNc synthétisé spécifique de l’amorce utilisée
- Random primers (amorces aléatoires) = mélange d’hexamères Population d’ADNc simple brin
- Oligo dT 102 4 - Clonage d’un fragment amplifié par

📝 Points essentiels

Les ADNc sont insérés dans des vecteurs plasmidiques pour créer des clones recombinants.
La sélection des clones recombinants utilise des gènes de résistance à des antibiotiques présents sur le vecteur.
La complémentation d’une β-galactosidase défective permet la sélection bleue/blanche sur milieu contenant X-Gal et IPTG, où les colonies blanches contiennent un insert.
Le criblage des banques d’ADNc peut être facilité par la présence de promoteurs pour transcription in vitro et séquences d’hybridation d’amorces pour séquençage.
➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc, gène ou morceau de gène (promoteurs….) = clonage moléculaire ➢ ADN d’intérêt peut être facilement modifié : délétion, insertion, mutations ponctuelles, fusion avec d’autres séquences … ➢ ADN disponible pour toute étude imaginable : séquençage, sonde moléculaire, expression (production d’ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 22 Collection de 111 900 plasmides provenant de 5157 équipes de recherche 06 2022 Fondé en 2004 Provenance de l’ADN exogène (insert) utilisé pour réaliser une construction : ➢ Plasmide recombinant ou autres types de vecteurs contenant une séquence d’ADN d’intérêt De nombreux plasmides recombinants proviennent de la construction de banques d’ADNc ou banques génomiques → voir plus loin ➢ ADN amplifié par PCR exemple : I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions Ligation Transformation Sélection Colonie bactérienne Vecteur 23 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 24 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilise des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert 5 étapes : ➢ Préparation de l’ADN : digestion(s), modification(s) puis purification de l’insert et du vecteur (vérification, dosage) A définir en fonction de la stratégie de clonage utilisée ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction 25 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Propriétés minimales d’un vecteur de clonage : ➢ Molécule qui se réplique, possède une origine de réplication autonome et relâchée → amplification et préparation faciles de l’ADN du vecteur ➢ Molécule d’ADN suffisamment petite (~ 3kpb) pour être facilement manipulable et pouvoir intégrer une séquence d’ADN exogène suffisamment grande ➢ Multisite de clonage (MCS), région qui contient des sites de restriction uniques → intégration d’une séquence d’ADN exogène ➢ Gène de résistance à un antibiotique → Sélection des plasmides recombinants I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilisation d’enzymes de restriction pour découper l’ ADN 26 ➢ Enzymes de restriction de type II, reconnait une séquence et coupe la séquence reconnue ➢ Séquence reconnue : palindrome à 6 bp, coupure tous les 46 = 4096 bp → ADN facilement manipulable ➢ Toutes les séquences palindromiques de 6 bp peuvent être reconnues et coupées par au moins 1 enzyme de restriction 27 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Comment identifier un site de restriction dans une séquence?

💡 À retenir

L’insertion d’ADNc dans des vecteurs plasmidiques permet la création de clones recombinants, sélectionnés efficacement par résistance aux antibiotiques ou coloration bleue/blanche.

📖 6. Organisation et répétitions dans le génome humain et implications pour le clonage

🔑 Notions clés & Définitions

Gènes codant des protéines : Segments d’ADN représentant environ 1,5 % du génome humain, correspondant aux régions transcrites en protéines.
Éléments mobiles d’ADN : Séquences dispersées dans le génome, comprenant transposons d’ADN, rétrotransposons à LTR et sans LTR, LINE, SINE, pouvant compliquer le clonage ciblé.

📝 Points essentiels

Les gènes codant des protéines représentent environ 1,5 % du génome humain.
Les répétitions en tandem incluent des ARNsn U2 et ARNr, avec des tailles et nombres de copies variables.
Les pseudogènes sont des séquences similaires aux gènes mais non fonctionnelles, résultant souvent d’une maturation, pouvant compliquer le clonage ciblé.

💡 À retenir

Les gènes codant des protéines représentent environ 1,5 % du génome humain.

📖 7. Types de vecteurs adaptés à la taille des inserts et taille des banques génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

Taille des inserts : Longueur des fragments d’ADN insérés dans un vecteur, qui influence la complexité et la couverture d’une banque génomique ou d’ADNc.
Banques génomiques : Collections de vecteurs recombinants contenant des fragments d’ADN génomique d’un organisme, visant à représenter la totalité ou une partie de son génome.

📝 Points essentiels

Les vecteurs plasmidiques sont adaptés pour des inserts d’environ 3 kb, tandis que les vecteurs BAC permettent le clonage de fragments de 100 à 300 kb.
La taille des inserts détermine le nombre de clones nécessaires pour couvrir un génome dans une banque génomique, en fonction de la taille du génome, de la taille moyenne des inserts et du nombre total de clones.
La couverture d’une banque génomique est calculée en utilisant la formule N = ln(1-P)/ln(1 - n/G), avec P = 0,99, où N est le nombre de clones nécessaires, n la taille moyenne des inserts, et G la taille du génome.

💡 À retenir

La taille des inserts détermine le nombre de clones nécessaires pour couvrir un génome dans une banque génomique, en fonction de la taille du génome, de la taille moyenne des inserts et du nombre total de clones.

📖 8. Principes et protocoles d’amplification par PCR pour clonage

🔑 Notions clés & Définitions

Clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage : 77 ADN génomique purifié 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc Parallèle avec les 5 étapes d’un clonage traditionnel ➢ Digestion(s), modification(s) puis purification de l’ insert et du vecteur ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction → criblage 78 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage par hybridation moléculaire 1/ préparation d’une sonde nucléotidique marquée 2/ hybridation moléculaire 3/ Révélation de la sonde Révélation et superposition avec la boîte de départ Sonde marquée Sonde nucléotidique marquée présentant une certaine homologie de séquence avec la séquence d’intérêt ou ADNc … Répété X fois (X= nombre de boîtes nécessaires pour étaler la banque) X est fonction de la taille du génome de l’organisme et de la taille des inserts 3 clones contiennent une séquence apparentée à la sonde utilisée Hybridation de la sonde avec les membranes 3 – Construction de banques génomiques ou d’ PCR 4 - 1 Introduction et rappels L’amplification d’ADN par PCR (vu ETG) Attention : longueur des amorces au moins 18 nt
sont spécifiques de l’ADN cible
ont une longueur de 18 nucléotides 418 = 6,87 10 10 nucléotides
une par brin
ont des extrémités 3’OH dirigées l’une vers l’autre
ont un % CG se situant entre 45% à 55%
ont des Tm voisines et situées entre 55°C et 70 °C Règle de Wallace : Tm = (A+T)x2°C + (G+C)x4°C
ne s’hybrident pas entre elles, ne se replient pas sur elles-mêmes 98 4-Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4-1 Introduction et rappels Les amorces : 99 4-Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4-1 Introduction et rappels Composition du milieu réactionnel de PCR :
Deux amorces
dNTP
ADN contenant la séquence à amplifier, ADN cible
ADN polymérase thermostable
Tampon adapté à la polymérase et contenant Mg2+ ou Mn2+ Protocole d’amplification : 25 à 30 cycles
30s à 95 °C dénaturation de l’ADN
30s à ≈Tm la plus basse-5°C =Th
Elongation, temps adapté à la longueur du fragment à amplifier, 30s à 1 min /1000 bp température adaptée à la polymérase utilisée Tm, melting temperature, température de fusion des amorces Th, température d’hybridation des amorces 100 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 1 Introduction Les étapes d’un clonage d’un ADN amplifié par PCR sont identiques à ce qui a été vu dans le clonage traditionnel.

📝 Points essentiels

La PCR permet l’amplification exponentielle d’une séquence d’ADN spécifique à partir d’un ADN matrice, en utilisant des cycles alternant dénaturation, hybridation des amorces et extension par ADN polymérase.
Chaque cycle de PCR double la quantité d’ADN cible, permettant une amplification rapide et spécifique pour le clonage.
Le protocole PCR est utilisé pour produire des fragments d’ADN à insérer dans des vecteurs pour le clonage.
➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc, gène ou morceau de gène (promoteurs….) = clonage moléculaire ➢ ADN d’intérêt peut être facilement modifié : délétion, insertion, mutations ponctuelles, fusion avec d’autres séquences … ➢ ADN disponible pour toute étude imaginable : séquençage, sonde moléculaire, expression (production d’ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Vecteur 23 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 24 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilise des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert 5 étapes : ➢ Préparation de l’ADN : digestion(s), modification(s) puis purification de l’insert et du vecteur (vérification, dosage) A définir en fonction de la stratégie de clonage utilisée ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction 25 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Propriétés minimales d’un vecteur de clonage : ➢ Molécule qui se réplique, possède une origine de réplication autonome et relâchée → amplification et préparation faciles de l’ADN du vecteur ➢ Molécule d’ADN suffisamment petite (~ 3kpb) pour être facilement manipulable et pouvoir intégrer une séquence d’ADN exogène suffisamment grande ➢ Multisite de clonage (MCS), région qui contient des sites de restriction uniques → intégration d’une séquence d’ADN exogène ➢ Gène de résistance à un antibiotique → Sélection des plasmides recombinants I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilisation d’enzymes de restriction pour découper l’ Vecteur 42 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 43 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Préparation de bactéries compétentes Souches de E.
ADNc 3 - 1 - Définitions De nombreux vecteurs recombinants disponibles proviennent de la construction de banques. Deux types de banques ont été construites : ➢ Banque génomique : collection de vecteurs recombinants, dans chaque vecteur a été intégré un morceau de l’ADN génomique d’un organisme donné. Toutes les séquences du génome de l’organisme sont représentées dans la banque. ➢ Banque d’ADNc : collection de vecteurs recombinants, dans chaque vecteur a été intégré un ADN complémentaire (ADNc) ou un morceau d’ADNc, d’un ARNm exprimé dans le type cellulaire ou le tissu de départ. Tous les ADNc du tissu de départ sont représentés dans la banque. 77 ADN génomique purifié 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc Parallèle avec les 5 étapes d’un clonage traditionnel ➢ Digestion(s), modification(s) puis purification de l’ insert et du vecteur ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction → criblage 78 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage par hybridation moléculaire 1/ préparation d’une sonde nucléotidique marquée 2/ hybridation moléculaire 3/ Révélation de la sonde Révélation et superposition avec la boîte de départ Sonde marquée Sonde nucléotidique marquée présentant une certaine homologie de séquence avec la séquence d’intérêt ou ADNc … Répété X fois (X= nombre de boîtes nécessaires pour étaler la banque) X est fonction de la taille du génome de l’organisme et de la taille des inserts 3 clones contiennent une séquence apparentée à la sonde utilisée Hybridation de la sonde avec les membranes 3 – Construction de banques génomiques ou d’

💡 À retenir

La PCR, par ses cycles thermiques, permet de produire rapidement des fragments d’ADN spécifiques destinés au clonage, en doublant la quantité à chaque cycle.

📖 9. Paramètres et conception des amorces pour amplification PCR

🔑 Notions clés & Définitions

Longueur des amorces : Paramètre de conception des amorces PCR généralement compris entre 18 et 25 nucléotides, assurant un équilibre entre spécificité de liaison et efficacité d’amplification.
Choix des amorces : Processus de sélection de séquences spécifiques à la région cible, avec un pourcentage de bases GC entre 45% et 55%, et des températures de fusion proches pour garantir une hybridation efficace.
Hybridation des amorces : Processus par lequel les amorces se lient spécifiquement à leur séquence complémentaire d’ADN lors du refroidissement, dépendant de la température de fusion et de la composition en bases.
Etapes pour la préparation : Séquence d’actions comprenant l’amplification par PCR de la séquence cible, la vérification du produit par électrophorèse, la modification des extrémités si nécessaire, et la purification pour optimiser la construction moléculaire.

📝 Points essentiels

Les amorces PCR sont des courtes séquences d’ADN complémentaires aux extrémités de la région cible à amplifier.
La température de fusion (Tm) des amorces doit être optimisée et proche entre les deux amorces pour une hybridation efficace.
La spécificité des amorces est cruciale pour éviter l’amplification non spécifique et obtenir un produit unique.
La longueur des amorces est généralement comprise entre 18 et 25 nucléotides pour un bon équilibre entre spécificité et efficacité.
PCR 4 - 1 Introduction Les étapes d’un clonage d’un ADN amplifié par PCR sont identiques à ce qui a été vu dans le clonage traditionnel. ➢ Préparation de l’insert et du vecteur Préparation de l’insert
Choix des amorces pour amplifier l’ADN à cloner (ADN cible)
Amplification de l’ADN à cloner
Vérification de l’efficacité de l’amplification puis purification de l’ADN amplifié et parallèlement préparation du vecteur adapté aux extrémités de l’insert ➢ Ligation de l’insert dans un vecteur de clonage ➢ Transformation de bactéries compétentes ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Différentes stratégies possibles en fonction de la situation de départ 105 4 - Clonage d’un fragment amplifié par
➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc, gène ou morceau de gène (promoteurs….) = clonage moléculaire ➢ ADN d’intérêt peut être facilement modifié : délétion, insertion, mutations ponctuelles, fusion avec d’autres séquences … ➢ ADN disponible pour toute étude imaginable : séquençage, sonde moléculaire, expression (production d’ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Vecteur 23 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 24 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilise des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert 5 étapes : ➢ Préparation de l’ADN : digestion(s), modification(s) puis purification de l’insert et du vecteur (vérification, dosage) A définir en fonction de la stratégie de clonage utilisée ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction 25 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Propriétés minimales d’un vecteur de clonage : ➢ Molécule qui se réplique, possède une origine de réplication autonome et relâchée → amplification et préparation faciles de l’ADN du vecteur ➢ Molécule d’ADN suffisamment petite (~ 3kpb) pour être facilement manipulable et pouvoir intégrer une séquence d’ADN exogène suffisamment grande ➢ Multisite de clonage (MCS), région qui contient des sites de restriction uniques → intégration d’une séquence d’ADN exogène ➢ Gène de résistance à un antibiotique → Sélection des plasmides recombinants I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilisation d’enzymes de restriction pour découper l’ Vecteur 35 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 36 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Ligation ou ligature des fragments d’ADN purifiés (Insert + vecteur) T4 DNA ligase en présence d’ATP, et de Mg++ Ligation possible entre ➢ Deux extrémités cohésives inverses complémentaires l’une de l’autre, extrémités compatibles ➢ Deux extrémités franches Toutes les extrémités franches sont compatibles entre elles Ligation entre deux extrémités cohésives compatibles plus favorable 37 Exemple #1 : ligation entre deux extrémités cohésives obtenues avec la même enzyme de restriction, fragments avec des extrémités cohésives PstI CTGCA/G 5’P 5’P 3’OH 3’OH CTGCA ACGTCG5’P G ATP, Mg++ T4 DNA ligase 5’P 3’OH CTGCA G 5’P 3’OH ACGTC G PstI Après ligation le site PstI est reconstitué I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel 5’P 3’OH 5’P 3’OH 3’OH CTGCA3’OH 5’P ADN digéré par Pst I CTGCA/G ADN digéré par Nsi I ATGCA/T 5’P 5’P 3’OH 3’OH CTGCAT GACGTA Après ligation, les 2 sites de restriction de départ sont perdus Exemple #2 : ligation entre deux extrémités cohésives obtenues après digestion par des enzymes différentes → enzymes compatibles G T ACGTA ATP, Mg++ T4 DNA ligase I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel 5’P 5’P 3’OH Digestion par l’enzyme Sma I CCC/GGG 5’P 3’OH 3’OH GGG 5’P 3’OH TAG ATC Digestion par l’enzyme EcoRV GAT/ATC Exemple #3 : ligation entre deux extrémités franches 5’P CCC GGG3’OH 5’P 3’OH TAG ATC Après ligation, les sites de restriction de départ sont perdus I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel ATP, Mg++T4 DNA ligase 3’OH 5’P 5’P ➢ ADN polymérase Extrémité EcoRI 5’ sortante Activité polymérase 5’→3’ 5’…G → 5’…GAATT T4 DNA polymérase ou 3’…CTTAA 3’…CTTAA DNA polymérase I fragment de Klenow + dNTP Extrémité PstI 3’sortante Activité exonucléase 3’ → 5’ 5’…CTGCA → 5’…C T4 DNA polymérase en absence de dNTP 3’…G 3’…G 40 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Transformation d’une extrémité cohésive en extrémité à bouts francs (quand pas d’extrémités compatibles disponibles).

💡 À retenir

Savoir concevoir des amorces adaptées pour garantir une amplification PCR spécifique et efficace.

📖 10. Composition du milieu réactionnel et déroulement du protocole PCR

🔑 Notions clés & Définitions

Clonage Traditionnel : Méthode de clonage utilisant des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert, suivie de ligation, transformation, sélection et vérification.

📝 Points essentiels

Le milieu réactionnel PCR contient de l’ADN polymérase thermostable (ex : Taq), des dNTPs, des amorces, un tampon et l’ADN matrice.
Le tampon réactionnel maintient un pH optimal et contient des ions nécessaires à l’activité enzymatique.
Le protocole PCR comprend une étape initiale de dénaturation, suivie de 25-35 cycles de dénaturation, hybridation et extension, puis une étape finale d’extension.
La température et la durée de chaque étape sont critiques pour la réussite de la PCR.
➢ Préparation de l’insert et du vecteur Préparation de l’insert
Choix des amorces pour amplifier l’ADN à cloner (ADN cible)
Amplification de l’ADN à cloner
Vérification de l’efficacité de l’amplification puis purification de l’ADN amplifié et parallèlement préparation du vecteur adapté aux extrémités de l’insert ➢ Ligation de l’insert dans un vecteur de clonage ➢ Transformation de bactéries compétentes ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Différentes stratégies possibles en fonction de la situation de départ 105 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Les régions les mieux conservées sont importantes pour l’activité biologique de la protéine DBD : DNA binding domain Domaine protéique du facteur de transcription HSF qui permet la reconnaissance et la liaison à une séquence spécifique d’ PCR 4 - 3 - Amplification Parfois il est difficile d’utiliser une température d’hybridation des amorces parfaitement adaptée à l’ADN cible par exemple lorsque des amorces dégénérées sont utilisées.
Modification des extrémités en présence de Taq polymérase ajoute un A à l’extrémité 3’ OH Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide PCR 4 – 8 - Gibson assembly, seamless cloning Assemblage de 3 fragments dans 1 vecteur Amplification par PCR des fragments et ajout d’une séquence identique à l’une des extrémités d’un fragment adjacent Incubation à 50°C, ADN polymérase et ligase sont thermostables 5’ exonuclease non thermostable → activité limitée à 50°C 4 - Clonage d’un fragment amplifié par

💡 À retenir

Maîtriser la composition et les étapes du protocole PCR pour assurer une amplification fiable et reproductible.

📖 11. Autres domaines d’application de la PCR et techniques associées

🔑 Notions clés & Définitions

**6 séances
TP 20 h** : Organisation des travaux pratiques répartis en 6 séances totalisant 20 heures, incluant des sessions spécifiques de bio-informatique et de laboratoire.
Amplification isotherme : Technique d'amplification de l'ADN fonctionnant à température constante, alternative à la PCR classique.
Molécule d’ADN recombinant (clonage : 51 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Vérification de la construction – Plusieurs colonies doivent être testées, au moins 10.

📝 Points essentiels

La RT-PCR permet la transcription inverse de l’ARN en ADNc suivie de l’amplification PCR, utile pour étudier l’expression génique.
La PCR quantitative (qPCR) permet de quantifier en temps réel la quantité d’ADN amplifié.
La PCR multiplex permet l’amplification simultanée de plusieurs cibles dans une même réaction.
➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc, gène ou morceau de gène (promoteurs….) = clonage moléculaire ➢ ADN d’intérêt peut être facilement modifié : délétion, insertion, mutations ponctuelles, fusion avec d’autres séquences … ➢ ADN disponible pour toute étude imaginable : séquençage, sonde moléculaire, expression (production d’ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 22 Collection de 111 900 plasmides provenant de 5157 équipes de recherche 06 2022 Fondé en 2004 Provenance de l’ADN exogène (insert) utilisé pour réaliser une construction : ➢ Plasmide recombinant ou autres types de vecteurs contenant une séquence d’ADN d’intérêt De nombreux plasmides recombinants proviennent de la construction de banques d’ADNc ou banques génomiques → voir plus loin ➢ ADN amplifié par PCR exemple : I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions Ligation Transformation Sélection Colonie bactérienne Vecteur 23 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 24 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilise des enzymes de restriction pour préparer le vecteur et l’insert 5 étapes : ➢ Préparation de l’ADN : digestion(s), modification(s) puis purification de l’insert et du vecteur (vérification, dosage) A définir en fonction de la stratégie de clonage utilisée ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction 25 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Propriétés minimales d’un vecteur de clonage : ➢ Molécule qui se réplique, possède une origine de réplication autonome et relâchée → amplification et préparation faciles de l’ADN du vecteur ➢ Molécule d’ADN suffisamment petite (~ 3kpb) pour être facilement manipulable et pouvoir intégrer une séquence d’ADN exogène suffisamment grande ➢ Multisite de clonage (MCS), région qui contient des sites de restriction uniques → intégration d’une séquence d’ADN exogène ➢ Gène de résistance à un antibiotique → Sélection des plasmides recombinants I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Utilisation d’enzymes de restriction pour découper l’ Vecteur 35 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 36 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Ligation ou ligature des fragments d’ADN purifiés (Insert + vecteur) T4 DNA ligase en présence d’ATP, et de Mg++ Ligation possible entre ➢ Deux extrémités cohésives inverses complémentaires l’une de l’autre, extrémités compatibles ➢ Deux extrémités franches Toutes les extrémités franches sont compatibles entre elles Ligation entre deux extrémités cohésives compatibles plus favorable 37 Exemple #1 : ligation entre deux extrémités cohésives obtenues avec la même enzyme de restriction, fragments avec des extrémités cohésives PstI CTGCA/G 5’P 5’P 3’OH 3’OH CTGCA ACGTCG5’P G ATP, Mg++ T4 DNA ligase 5’P 3’OH CTGCA G 5’P 3’OH ACGTC G PstI Après ligation le site PstI est reconstitué I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel 5’P 3’OH 5’P 3’OH 3’OH CTGCA3’OH 5’P ADN digéré par Pst I CTGCA/G ADN digéré par Nsi I ATGCA/T 5’P 5’P 3’OH 3’OH CTGCAT GACGTA Après ligation, les 2 sites de restriction de départ sont perdus Exemple #2 : ligation entre deux extrémités cohésives obtenues après digestion par Vecteur 42 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage, vue d’ensemble Insert Provient d’un plasmide recombinant ou est amplifié par PCR MCS : multi site de clonage XR : gène conférant la résistance à un antibiotique 43 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Préparation de bactéries compétentes Souches de E.

💡 À retenir

Les diverses techniques avancées d’amplification de l’ADN, telles que la RT-PCR, la PCR quantitative, la PCR multiplex et l’amplification isotherme, permettent des analyses génétiques précises et multiples adaptées à différents besoins en génétique.

📖 12. Production de protéines recombinantes

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

La production de protéines recombinantes consiste à exprimer un gène d’intérêt dans un système hôte pour obtenir la protéine correspondante.
Les systèmes d’expression peuvent être bactériens, eucaryotes ou in vitro, choisis selon la nature de la protéine.
L’expression génique est contrôlée par des promoteurs spécifiques présents sur le vecteur d’expression.
La purification des protéines recombinantes utilise des techniques comme la chromatographie pour isoler la protéine d’intérêt.
ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 79 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine codée par le gène d’intérêt Possible uniquement pour une banque génomique procaryote, gènes courts (sans intron) et promoteurs fonctionnels chez E. coli Réplique des colonies sur une membrane de nitrocellulose Lyse des bactéries Afin de rendre les protéines accessibles Dépots de protéines invisibles là où étaient les colonies bactériennes Incubation des membranes avec premier et second anticorps puis révélation La protéine d’intérêt est exprimée dans 3 des clones de la banque 3 – Construction de banques génomiques ou d’
77 ADN génomique purifié 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc Parallèle avec les 5 étapes d’un clonage traditionnel ➢ Digestion(s), modification(s) puis purification de l’ insert et du vecteur ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction → criblage 78 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage par hybridation moléculaire 1/ préparation d’une sonde nucléotidique marquée 2/ hybridation moléculaire 3/ Révélation de la sonde Révélation et superposition avec la boîte de départ Sonde marquée Sonde nucléotidique marquée présentant une certaine homologie de séquence avec la séquence d’intérêt ou ADNc … Répété X fois (X= nombre de boîtes nécessaires pour étaler la banque) X est fonction de la taille du génome de l’organisme et de la taille des inserts 3 clones contiennent une séquence apparentée à la sonde utilisée Hybridation de la sonde avec les membranes 3 – Construction de banques génomiques ou d’ ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 79 Criblage, screening → recherche et purification d’un clone contenant la séquence d’intérêt parmi tous les clones de la banque Criblage à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine codée par le gène d’intérêt Possible uniquement pour une banque génomique procaryote, gènes courts (sans intron) et promoteurs fonctionnels chez E.

💡 À retenir

La production de protéines recombinantes consiste à exprimer un gène d’intérêt dans un système hôte pour obtenir la protéine correspondante.

🧩 Compléments de couverture

Détail source à réviser : [email protected] 9, Avenue du Professeur Léon Bernard, campus de l’EHESP, Villejean GENIE GENETIQUE I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) II - Modification d’une molécule d’ADN III - Au (Source: "[email protected] 9, Avenue du Professeur Léon Bernard, campus de l’EHESP, Villejean GENIE GENETIQUE I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) II - Modification d’une molécule d’ADN III - Autres domaines d’application de la PCR et techniques associées IV - Amplification isotherme de l’ADN V -")
Détail source à réviser : + 0,50CCS] ; [0,10CC2 + 0,90CCS] 6 Molecular biology / David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, Michelle R. McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A S _(Source: "+ 0,50CCS] ; [0,10CC2 + 0,90CCS] 6 Molecular biology / David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, Michelle R. McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A Salle Jaune et Rouge TP2 4h30 TP3 4h30 TP5 6h00 Imprimer le poly et les fiches de comptes rendus Blouse et marqueur 8 Connaissances")_
Détail source à réviser : 1 – Généralités et Définitions ADN recombinant définition : molécule d'ADN construite au laboratoire et constituée de matériel génétique provenant de sources multiples. Un morceau d’ADN est inséré dans 1 vecteur (plasmid (Source: "1 – Généralités et Définitions ADN recombinant définition : molécule d'ADN construite au laboratoire et constituée de matériel génétique provenant de sources multiples. Un morceau d’ADN est inséré dans 1 vecteur (plasmide, virus) ADN exogène Vecteur ADN recombinant 12 Vecteur : Support ADN dans lequel est inséré l’ADN exogène. Le vecteur se")
Détail source à réviser : des plasmides linéarisés peuvent être estimées grâce à ces marqueurs Covalently closed circular (ccc) Circulaire super enroulé Open circular (oc) Circulaire relâché Linéaire Très rare avant coupure par une enzyme de rest (Source: "des plasmides linéarisés peuvent être estimées grâce à ces marqueurs Covalently closed circular (ccc) Circulaire super enroulé Open circular (oc) Circulaire relâché Linéaire Très rare avant coupure par une enzyme de restriction Vecteur natif Sera vu en TP3 Vecteur natif = non modifié par l’action d’une enzyme 17 Propriétés minimales d’un vecteur de")
Détail source à réviser : hôte Origine de Réplication I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 21 Une origine de réplication relâchée permet d’obtenir plusieurs copies du plasmide / cellule bactér (Source: "hôte Origine de Réplication I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 21 Une origine de réplication relâchée permet d’obtenir plusieurs copies du plasmide / cellule bactérienne → facilite l’extraction d’ADN plasmidique Plasmides communs Nombre de copies ORI Origine de réplication pUC ~500-700 pMB1")
Détail source à réviser : TCATTGCGATGCGTCATTGCCAGTCATTAAATGATCATATGC Ecriture sur un seul brin → GAT/ATC Eco R V 28 2 - Clonage Traditionnel La même séquence palindromique peut être reconnue et coupée par des enzymes différentes Isoschizomères : (Source: "TCATTGCGATGCGTCATTGCCAGTCATTAAATGATCATATGC Ecriture sur un seul brin → GAT/ATC Eco R V 28 2 - Clonage Traditionnel La même séquence palindromique peut être reconnue et coupée par des enzymes différentes Isoschizomères : enzymes de restriction provenant d’espèces bactériennes différentes mais qui partagent la même séquence de reconnaissance Isoschizomères ne")
Détail source à réviser : d’affinité sur silice pour récupérer l’ADN d’intérêt → obtention d’une solution d’ADN purifié ADN du vecteur et ADN de l’insert 30 31 Molécule à purifier en solution Molécule pour laquelle la molécule à purifier à une fo (Source: "d’affinité sur silice pour récupérer l’ADN d’intérêt → obtention d’une solution d’ADN purifié ADN du vecteur et ADN de l’insert 30 31 Molécule à purifier en solution Molécule pour laquelle la molécule à purifier à une forte affinité, fixée sur une matrice insoluble. Molécules éliminées par lavages I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant")
Détail source à réviser : Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Transformation d’une extrémité cohésive en extrémité à bouts francs (quand pas d’extrémités compatibles disponibles). Ligation Transformati (Source: "Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Transformation d’une extrémité cohésive en extrémité à bouts francs (quand pas d’extrémités compatibles disponibles). Ligation Transformation Sélection Colonie bactérienne Vecteur 42 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Clonage,")
Détail source à réviser : simplifié, plusieurs copies du plasmide/bactérie Soc medium : milieu de culture riche 49 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Efficacité de transformation : colonies ou col (Source: "simplifié, plusieurs copies du plasmide/bactérie Soc medium : milieu de culture riche 49 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Efficacité de transformation : colonies ou colony forming units cfu/μg ADN Cette valeur varie en fonction de la souche bactérienne, de la technique utilisée (compétence et")
Détail source à réviser : c c v cc c c c c cc c c c c c c c c c c c c c v c c c c c c c c c c c c c c c c c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c v c c c v c c c LB agar Obtention d’un tapis bactérien Sélection sur LB a (Source: "c c v cc c c c c cc c c c c c c c c c c c c c v c c c c c c c c c c c c c c c c c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c c cc c c v c c c v c c c LB agar Obtention d’un tapis bactérien Sélection sur LB agar + antibiotique de sélection en accord avec le gène de résistance présent sur le vecteur Ici 14 clones positifs sont obtenus. Ils")
Détail source à réviser : d’ADN en présence de ddNTP fluorescents I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel – Vérification finale d’une colonie qui apparait correcte par séquençage Sanger Fragment à puri (Source: "d’ADN en présence de ddNTP fluorescents I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel – Vérification finale d’une colonie qui apparait correcte par séquençage Sanger Fragment à purifier Site EcoRI : Site EcoRI unique de vecteur GAATTC CTTAAG Digestion par EcoRI G-3’OH CTTAA-5’p 5’-pAATTC 3’OH-G CTTAAG GAATTC")
Détail source à réviser : (antartic), à 65°C (shrimp) 20 min, par extraction (CIAP, phénol/chloroforme) 5’p-AATTC 3’OH-G G-3’OH CTTAA-5’p 2/Ligation Incubation en présence ADN ligase dans un tampon contenant de l’ATP + Mg++ Insert purifié et digé (Source: "(antartic), à 65°C (shrimp) 20 min, par extraction (CIAP, phénol/chloroforme) 5’p-AATTC 3’OH-G G-3’OH CTTAA-5’p 2/Ligation Incubation en présence ADN ligase dans un tampon contenant de l’ATP + Mg++ Insert purifié et digéré par EcoRI Vecteur digéré par EcoRI puis déphosphorylé Molécules en présence après l’étape de purification 2 - Clonage Traditionnel")
Détail source à réviser : le vecteur Idem de l’autre coté et sur le second type de plasmide recombinant G-3’OH5’p-AATTC 3’OH-G CTTAA-5’pGAATTC CTTAAG Vecteur de départ GAATTC CTTAAG Insert G-3’OH CTTAA AATTC 3’OH-G vecteur Insert 2 - Clonage Trad (Source: "le vecteur Idem de l’autre coté et sur le second type de plasmide recombinant G-3’OH5’p-AATTC 3’OH-G CTTAA-5’pGAATTC CTTAAG Vecteur de départ GAATTC CTTAAG Insert G-3’OH CTTAA AATTC 3’OH-G vecteur Insert 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 1 - Clonage d’un insert dans un vecteur au site EcoRI Après transformation, 3 types de colonies sont possibles Très rare")
Détail source à réviser : EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction ? ➢ Taille des fragments attendus après électrophorèse sur gel d’agarose? (Source: "EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction ? ➢ Taille des fragments attendus après électrophorèse sur gel d’agarose? 62 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 1 - Clonage d’un insert dans un vecteur au site EcoRI Vérification de la construction par digestion")
Détail source à réviser : AmpR Ori Remarque : Si digestion incomplète par les 2 enzymes, il est possible d’obtenir des colonies contenant le plasmide de départ (plasmide sauvage) 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 2 : clonage directionnel , utili (Source: "AmpR Ori Remarque : Si digestion incomplète par les 2 enzymes, il est possible d’obtenir des colonies contenant le plasmide de départ (plasmide sauvage) 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 2 : clonage directionnel , utilisation de 2 sites de restriction différents 66 Trois stratégies sont possibles Dans l’ordre de préférence ➢ Clonage directionnel")
Détail source à réviser : d’ADN du chromosome bactérien 2 - Clonage Traditionnel Exemples de vecteurs de clonage Avec le plasmide Bluescript SK l’étape de sélection est simplifiée grâce à la complémentation d’une béta-galactosidase défective + IP (Source: "d’ADN du chromosome bactérien 2 - Clonage Traditionnel Exemples de vecteurs de clonage Avec le plasmide Bluescript SK l’étape de sélection est simplifiée grâce à la complémentation d’une béta-galactosidase défective + IPTG, isopropyl thiogalactoside analogue non métablolisable du lactose 71 X-Gal, substrat incolore transformé par la β-galactosidase en")
Détail source à réviser : sens in vitro (vu ETG) ➢ Séquence permettant l’hybridation d’amorces courantes utilisables pour le séquençage par la technique de Sanger Autres éléments souvent présents sur un vecteur de clonage plasmidique 2 - Clonage (Source: "sens in vitro (vu ETG) ➢ Séquence permettant l’hybridation d’amorces courantes utilisables pour le séquençage par la technique de Sanger Autres éléments souvent présents sur un vecteur de clonage plasmidique 2 - Clonage Traditionnel 75 2 - Clonage Traditionnel Vecteur de clonage, en résumé Séquences et propriétés obligatoires ➢ Petite taille ≈ 3000 bp ➢")
Détail source à réviser : La taille des génomes varie en fonction de l’organisme Organisme nombre de gènes ADN bp nombre de chromosomes Mbp = mega paires de bases 106 bp 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une (Source: "La taille des génomes varie en fonction de l’organisme Organisme nombre de gènes ADN bp nombre de chromosomes Mbp = mega paires de bases 106 bp 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique Vector type Maximun Insert Size (kbp) Plasmide multi-copies 10 Bactériophage Lamda 20 Cosmid 45 Plasmide P1 100 BAC")
Détail source à réviser : clones Nombre de filtres (X) Espèce Taille genome kbp N plasmide N BAC Banque plasmide Banque BAC E. coli 4500 1034 67 4 1 A. thaliana 70000 16116 1072 64 2 H. sapiens 3060000 704589 46970 2818 94 Taille de la banque en (Source: "clones Nombre de filtres (X) Espèce Taille genome kbp N plasmide N BAC Banque plasmide Banque BAC E. coli 4500 1034 67 4 1 A. thaliana 70000 16116 1072 64 2 H. sapiens 3060000 704589 46970 2818 94 Taille de la banque en fonction de la taille du génome et de la taille des inserts 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une")
Détail source à réviser : sont pas répétées dans le génome ; n.a. non applicable. Source : International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931. Classe Longueur Nombre de copies dans le génome humain Frac (Source: "sont pas répétées dans le génome ; n.a. non applicable. Source : International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931. Classe Longueur Nombre de copies dans le génome humain Fraction du génome humain (en %) $ Gènes codant des protéines 0,5-2 200 kbp ͌ 19 000 40* (2,0)† Longs gènes d’ARN non codant 0,2-50 kbp ͌ 10")
Détail source à réviser : à intégrer dans le vecteur sont plus courtes et moins nombreuses (par exemple moins de 1,1% du génome humain). Première Etape : purification des ARNm par chromatographie sur oligo dT Longueur 18 nt 85 Molécule à purifier (Source: "à intégrer dans le vecteur sont plus courtes et moins nombreuses (par exemple moins de 1,1% du génome humain). Première Etape : purification des ARNm par chromatographie sur oligo dT Longueur 18 nt 85 Molécule à purifier + ARNm Molécule pour laquelle la molécule à purifier à un forte affinité, fixée sur une matrice insoluble + oligo dT Molécules")
Détail source à réviser : en suspension dans H20 ou TE 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 8,0 Surnageant = solution contenant les ARNm purifiés 88 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Les ARNm sont conv (Source: "en suspension dans H20 ou TE 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 8,0 Surnageant = solution contenant les ARNm purifiés 88 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Les ARNm sont convertis en ADNc en utilisant soit de amorces oligo(dT) soit des random primers (hexamères composées de toutes les séquences possibles de 6")
Détail source à réviser : de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Ajout d’un site de restriction aux ADNc double brins synthétisés à l’aide de linkers Purification des ADNc digérés avant la ligation avec le vecteu (Source: "de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Ajout d’un site de restriction aux ADNc double brins synthétisés à l’aide de linkers Purification des ADNc digérés avant la ligation avec le vecteur digéré par une enzyme compatible Linker : petite séquence d’ADN comprenant un site de restriction Par exemple Linker EcoRI :")
Détail source à réviser : 94 3 - Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Le criblage devient inutile car les méthodes de séquençage de nouvelles génération permettent de séquencer tous les clones d’un (Source: "94 3 - Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Le criblage devient inutile car les méthodes de séquençage de nouvelles génération permettent de séquencer tous les clones d’une banque 3 - Construction de banques génomiques ou d’ADNc Les séquences sont disponibles pour toute la communauté scientifique Les")
Détail source à réviser : un ARN (vu en ETG) Trois types d’amorçage pour la reverse transcription sont possibles : • Amorce spécifique d’un ARNm, ADNc synthétisé spécifique de l’amorce utilisée • Random primers (amorces aléatoires) = mélange d’he (Source: "un ARN (vu en ETG) Trois types d’amorçage pour la reverse transcription sont possibles : • Amorce spécifique d’un ARNm, ADNc synthétisé spécifique de l’amorce utilisée • Random primers (amorces aléatoires) = mélange d’hexamères Population d’ADNc simple brin • Oligo dT 102 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 1 Introduction et rappels RT-PCR (RT")
Détail source à réviser : de l’insert ➢ Ligation de l’insert dans un vecteur de clonage ➢ Transformation de bactéries compétentes ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Différentes stratégies possibles en fonction de la situation de départ (Source: "de l’insert ➢ Ligation de l’insert dans un vecteur de clonage ➢ Transformation de bactéries compétentes ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Différentes stratégies possibles en fonction de la situation de départ 105 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 1 Introduction ADN de départ Difficulté ➢ ADN génomique ++++++ ➢ ADNc simple brin")
Détail source à réviser : amorces 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 Choix des amorces 107 Cas 3 et 4 3 - Séquence inconnue mais une séquence équivalente a été clonée et séquencée chez d’autres espèces 4 - Séquence inconnue mais qui (Source: "amorces 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 Choix des amorces 107 Cas 3 et 4 3 - Séquence inconnue mais une séquence équivalente a été clonée et séquencée chez d’autres espèces 4 - Séquence inconnue mais qui appartient à une famille dont plusieurs membres ont été clonés et séquence Alignement de séquences permet de mettre en évidence des")
Détail source à réviser : régions les mieux conservées sont importantes pour l’activité biologique de la protéine DBD : DNA binding domain Domaine protéique du facteur de transcription HSF qui permet la reconnaissance et la liaison à une séquence (Source: "régions les mieux conservées sont importantes pour l’activité biologique de la protéine DBD : DNA binding domain Domaine protéique du facteur de transcription HSF qui permet la reconnaissance et la liaison à une séquence spécifique d’ADN 113 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2- Choix des amorces Les régions les mieux conservées sont")
Détail source à réviser : AAC ACC CAC GCC GGC ACA GCA GGA ACG GCG GGG Amorces de 20 nucléotides Une seule des ces 64 amorces correspond exactement à la séquence d’ADN cible 116 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces (Source: "AAC ACC CAC GCC GGC ACA GCA GGA ACG GCG GGG Amorces de 20 nucléotides Une seule des ces 64 amorces correspond exactement à la séquence d’ADN cible 116 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Cas 5 : Séquence totalement inconnue → choix des amorces dans une séquence voisine connue, PCR inverse Matériel de départ : ADN génomique")
Détail source à réviser : d’une ADN polymérases thermostables possédant une activité exonucléasique 3’→5 (relecture, proofreading) pour limiter les erreurs dans le fragment amplifié. Certaines ADN polymérases thermostables ont une activité exonuc (Source: "d’une ADN polymérases thermostables possédant une activité exonucléasique 3’→5 (relecture, proofreading) pour limiter les erreurs dans le fragment amplifié. Certaines ADN polymérases thermostables ont une activité exonucléasique 3’→5’ 120 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification c c La Taq polymérase a un taux d’erreur trop élevée")
Détail source à réviser : par PCR 4 - 3 - Amplification Amplicon de grande taille → Long range PCR 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification Parfois il est difficile d’utiliser une température d’hybridation des amorces parf (Source: "par PCR 4 - 3 - Amplification Amplicon de grande taille → Long range PCR 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification Parfois il est difficile d’utiliser une température d’hybridation des amorces parfaitement adaptée à l’ADN cible par exemple lorsque des amorces dégénérées sont utilisées. Résultat PCR réussie PCR avec manque de")
Détail source à réviser : : ➢ Préparation insert suivant l’une des trois stratégies et préparation vecteur du vecteur adapté ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amp (Source: ": ➢ Préparation insert suivant l’une des trois stratégies et préparation vecteur du vecteur adapté ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible avec ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’ 2. Vérification du produit de PCR par")
Détail source à réviser : Taq polymérase ajoute un A à l’extrémité 3’ OH Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase 4. Purification 132 133 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning Préparation du vecteur: • D (Source: "Taq polymérase ajoute un A à l’extrémité 3’ OH Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase 4. Purification 132 133 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning Préparation du vecteur: • Digestion par une enzyme de restriction du MCS qui génère des bouts francs • Ajout des T en 3’OH + Taq polymérase dTTP EcoRV SmaI 134 4 -")
Détail source à réviser : EcoRI et Bam HI puis purifié Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible et addition de sites de restriction 2. Vérification du produit de PCR par électrophorèse 3. Digestion du (Source: "EcoRI et Bam HI puis purifié Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible et addition de sites de restriction 2. Vérification du produit de PCR par électrophorèse 3. Digestion du produit PCR par des enzymes de restriction 4. Purification 137 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel")
Détail source à réviser : par PCR 4 - 7 - Clonage d’une séquence totalement inconnue RACE PCR Rapid amplification of cDNA ends Exemple de l’amplification d’une extrémité 5’ inconnue Intégration dans un vecteur suivant l’une des stratégies décrite (Source: "par PCR 4 - 7 - Clonage d’une séquence totalement inconnue RACE PCR Rapid amplification of cDNA ends Exemple de l’amplification d’une extrémité 5’ inconnue Intégration dans un vecteur suivant l’une des stratégies décrites précédemment→ ADN disponible pour séquençage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 7 - clonage d’une séquence totalement")
Détail source à réviser : 1 vecteur Amplification par PCR des fragments et ajout d’une séquence identique à l’une des extrémités d’un fragment adjacent Incubation à 50°C, ADN polymérase et ligase sont thermostables 5’ exonuclease non thermostable (Source: "1 vecteur Amplification par PCR des fragments et ajout d’une séquence identique à l’une des extrémités d’un fragment adjacent Incubation à 50°C, ADN polymérase et ligase sont thermostables 5’ exonuclease non thermostable → activité limitée à 50°C 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 8 - Gibson assembly, seamless cloning 4 - Clonage d’un fragment")
Détail source à réviser : par recombinaison Basé sur l’intégration du bactériophage lambda dans le génome de E. coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC (Source: "par recombinaison Basé sur l’intégration du bactériophage lambda dans le génome de E. coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC 11 mars - 45 min Programme : Cours I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) TD 1 – TD2 – TD3 4 - Clonage d’un")
Détail source à réviser : gyrase) est toxique pour les bactéries sauf si elles expriment l’antidote ccdA2ème étape : Recombinaison 90 à 99 % de colonies positives Divers types de vecteurs sont disponibles Vecteurs d’expression utilisables dans di (Source: "gyrase) est toxique pour les bactéries sauf si elles expriment l’antidote ccdA2ème étape : Recombinaison 90 à 99 % de colonies positives Divers types de vecteurs sont disponibles Vecteurs d’expression utilisables dans divers systèmes Bactéries, Levures, cellules de mammifères Vecteur viraux 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par")
Détail source à réviser : 3CC1+ 0,25CC2 + 0,45CCS] ; [0,25CC2+ 0,75CCS] 5 EVALUATION - 3ECTS Contrôle continu CC1 - Ecrit 1h 09 mars CC2 - CR TP1 et TP4 CCS - Ecrit 1h30 07 mai UE 3 ECTS Note = max[0,35CC1 + 0,15CC2 + 0,50CCS] ; [0,10CC2 _(Source: "3CC1+ 0,25CC2 + 0,45CCS] ; [0,25CC2+ 0,75CCS] 5 EVALUATION - 3ECTS Contrôle continu CC1 - Ecrit 1h 09 mars CC2 - CR TP1 et TP4 CCS - Ecrit 1h30 07 mai UE 3 ECTS Note = max[0,35CC1 + 0,15CC2 + 0,50CCS] ; [0,10CC2 + 0,90*CCS] 6 Molecular biology / David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, Michelle R. McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séance...")_
Détail source à réviser : I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 13 Pourquoi construire des molécules d’ADN recombinant ? ➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc (Source: "I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 13 Pourquoi construire des molécules d’ADN recombinant ? ➢ Permet de conserver et d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt : ADNc, gène ou morceau de gène (promoteurs….) = clonage moléculai")
Détail source à réviser : 1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmide bactérien I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonag (Source: "1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmide bactérien I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant")
Détail source à réviser : 1 enzyme de restriction 27 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Comment identifier un site de restriction dans une séquence? ➢ Analyse bio informatique → séance TP 1 ➢ Méth (Source: "1 enzyme de restriction 27 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel Comment identifier un site de restriction dans une séquence? ➢ Analyse bio informatique → séance TP 1 ➢ Méthode manuelle pour trouver des sites de restriction à 6 bp AC")
Détail source à réviser : purifié ADN du vecteur et ADN de l’insert 30 31 Molécule à purifier en solution Molécule pour laquelle la molécule à purifier à une forte affinité, fixée sur une matrice insoluble. (Source: "purifié ADN du vecteur et ADN de l’insert 30 31 Molécule à purifier en solution Molécule pour laquelle la molécule à purifier à une forte affinité, fixée sur une matrice insoluble.")
Détail source à réviser : Deux stratégies sont possibles, ADN polymérases ou endonucléase. (Source: "Deux stratégies sont possibles, ADN polymérases ou endonucléase.")
Détail source à réviser : Valeur maximum obtenue pour pUC19 2686pb super coiled, plasmide natif 2-4 1010cfu/\mu{}g par électroporation Plasmide recombinant obtenu après ligation, relâché (open circular) et plus grand → Efficacité de transformation pl (Source: "Valeur maximum obtenue pour pUC19 2686pb super coiled, plasmide natif 2-4 1010cfu/\mu{}g par électroporation Plasmide recombinant obtenu après ligation, relâché (open circular) et plus grand → Efficacité de transformation plus faible, 104cfu/\mu{}g à 107cfu/ \mu{}g 50Luria Broth (LB), milieu de culture I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant")
Détail source à réviser : 10. ➢ Soit vérification de la construction par digestion de restriction x 10 ➢ Extraction d’ADN plasmidique ➢ Digestion de restriction ➢ Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose Culture de nuit à 37 °C 52 I - Constru (Source: "10. ➢ Soit vérification de la construction par digestion de restriction x 10 ➢ Extraction d’ADN plasmidique ➢ Digestion de restriction ➢ Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose Culture de nuit à 37 °C 52 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 2 - Clonage Traditionnel ➢ soit PCR sur colonie")
Détail source à réviser : 2000 bp EcoR I BamHI HindIII EcoRI Pst1 EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction (Source: "2000 bp EcoR I BamHI HindIII EcoRI Pst1 EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction")
Détail source à réviser : Taille des fragments attendus après électrophorèse sur gel d’agarose? 62 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 1 - Clonage d’un insert dans un vecteur au site EcoRI Vérification de la construction par digestion de restricti (Source: "Taille des fragments attendus après électrophorèse sur gel d’agarose? 62 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 1 - Clonage d’un insert dans un vecteur au site EcoRI Vérification de la construction par digestion de restriction Numéro colonie testée M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5 kpb 4 kbp")
Détail source à réviser : teurs de clonages sont disponibles avec des MCS différents → Plus de possibilité d’intégration d’un ADN exogène + diverses versions de chaque type de vecteur 2 - Clonage Traditionnel Exemples de vecteurs de clonage 73 (Source: "teurs de clonages sont disponibles avec des MCS différents → Plus de possibilité d’intégration d’un ADN exogène + diverses versions de chaque type de vecteur 2 - Clonage Traditionnel Exemples de vecteurs de clonage 73")
Détail source à réviser : représentée par la taille moyenne de l'insert (c'est-à-dire taille moyenne de l'insert/taille du génome) Calculs faits pour 500 colonies par filtres N, Nombre de clones Nombre de filtres (X) Espèce Taille genome kbp N pl (Source: "représentée par la taille moyenne de l'insert (c'est-à-dire taille moyenne de l'insert/taille du génome) Calculs faits pour 500 colonies par filtres N, Nombre de clones Nombre de filtres (X) Espèce Taille genome kbp N plasmide N BAC Banque plasmide Banque BAC E. coli 4500 1034 67 4 1 A. thaliana 70000 16116 1072 64 2 H. sapiens 3060000 704589 46970 2818 9...")
Détail source à réviser : 2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931 (Source: "2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931")
Détail source à réviser : nstruction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc 90 RT « superscript », in vitrogen, sans activité RNAse H permet la synthèse d’ADNc plus long Ajout de RNAse H dans un deuxième temps po (Source: "nstruction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc 90 RT « superscript », in vitrogen, sans activité RNAse H permet la synthèse d’ADNc plus long Ajout de RNAse H dans un deuxième temps pour éliminer les ARN 3 – Construction de banqu")
Détail source à réviser : 4 3 - Séquence inconnue mais une séquence équivalente a été clonée et séquencée chez d’autres espèces 4 - Séquence inconnue mais qui appartient à une famille dont plusieurs membres ont été clonés et séquence Alignement (Source: "4 3 - Séquence inconnue mais une séquence équivalente a été clonée et séquencée chez d’autres espèces 4 - Séquence inconnue mais qui appartient à une famille dont plusieurs membres ont été clonés et séquence Alignement")
Détail source à réviser : E. Masser, Michela Ciccarelli, Claes Andréasson, Hsf1 on a leash – controlling the heat shock response by chaperone titration,Experimental Cell Research,Volume 396, Issue 1, 2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment ampl (Source: "E. Masser, Michela Ciccarelli, Claes Andréasson, Hsf1 on a leash – controlling the heat shock response by chaperone titration,Experimental Cell Research,Volume 396, Issue 1, 2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Ces séquences conservées permettent de choisir des amorces utilisables pour amplifier une séquence...")
Détail source à réviser : Certaines ADN polymérases thermostables ont une activité exonucléasique 3’→5’ 120 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification c c La Taq polymérase a un taux d’erreur trop élevée pour être utilisée p (Source: "Certaines ADN polymérases thermostables ont une activité exonucléasique 3’→5’ 120 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification c c La Taq polymérase a un taux d’erreur trop élevée pour être utilisée pour amplifier de l’ADN que l’on souhaite cloner")
Détail source à réviser : ites de restriction Les cinq étapes du clonage : ➢ Préparation insert suivant l’une des trois stratégies et préparation vecteur du vecteur adapté ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction (Source: "ites de restriction Les cinq étapes du clonage : ➢ Préparation insert suivant l’une des trois stratégies et préparation vecteur du vecteur adapté ➢ Ligation ➢ Transformation ➢ Sélection ➢ Vérification de la construction Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible avec ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’ 2. Vé...")
Détail source à réviser : tes de restriction Exemple les sites BamHI /EcoRI sont ajoutés aux extrémités de l’insert au cours de l’amplification, suite Insert digéré par EcoRI et Bam HI puis purifié Vecteur digéré par EcoRI et Bam HI puis purifié (Source: "tes de restriction Exemple les sites BamHI /EcoRI sont ajoutés aux extrémités de l’insert au cours de l’amplification, suite Insert digéré par EcoRI et Bam HI puis purifié Vecteur digéré par EcoRI et Bam HI puis purifié Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible et addition de sites de restriction 2. Vérificatio...")
Détail source à réviser : E. coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC 11 mars - 45 min Programme : Cours I - Construction d’une molécule d’ADN recombina (Source: "E. coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC 11 mars - 45 min Programme : Cours I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) TD 1 – TD2 – TD3 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTX...")
Détail source à réviser : uences permettant la recombinaison attB1 et attB2 sont des séquences différentes → clonage directionnel 152 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison Gène de résistance à la (Source: "uences permettant la recombinaison attB1 et attB2 sont des séquences différentes → clonage directionnel 152 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison Gène de résistance à la")
Détail source à réviser : 3. Modifications des extrémités : Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase + ATP 4 (Source: "3. Modifications des extrémités : Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase + ATP 4")
Détail source à réviser : ur : • digestion par une enzyme qui génère des extrémités franches • déphosphorylation des extrémités 5’P du vecteur puis inactivation de l’enzyme SmaI EcoRV 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning (Source: "ur : • digestion par une enzyme qui génère des extrémités franches • déphosphorylation des extrémités 5’P du vecteur puis inactivation de l’enzyme SmaI EcoRV 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning Etapes pour la préparation de l’insert : 1. Amplification par PCR de la séquence cible, ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’, 2. Vérif...")
Détail source à réviser : 1 – Généralités et Définitions 18 Plasmides découverts fin des années 1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmi (Source: "1 – Généralités et Définitions 18 Plasmides découverts fin des années 1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmide bactérien I - Construction d’une molé")
Détail source à réviser : 2000 Longueur maximale approximative de l'ADN pouvant être cloné dans des vecteurs 81 Pour limiter la taille des banques, des vecteurs qui permettent d’accepter des inserts plus grands ont été développés 3 – Construction (Source: "2000 Longueur maximale approximative de l'ADN pouvant être cloné dans des vecteurs 81 Pour limiter la taille des banques, des vecteurs qui permettent d’accepter des inserts plus grands ont été développés 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 8")
Détail source à réviser : 2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Ces séquences conservées permettent de choisir des amorces utilisables pour amplifier une séquence inconnue Problème → Code génétique r (Source: "2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Ces séquences conservées permettent de choisir des amorces utilisables pour amplifier une séquence inconnue Problème → Code génétique redondant 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Concep")
Détail source à réviser : 1. Amplification par PCR de la séquence cible avec ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’ 2 (Source: "1. Amplification par PCR de la séquence cible avec ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’ 2")
Détail source à réviser : 1. Amplification par PCR de la séquence cible, ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’, 2 (Source: "1. Amplification par PCR de la séquence cible, ADN pol avec activité exonucléase 3’→5’, 2")
Détail source à réviser : 3. Modification des extrémités en présence de Taq polymérase ajoute un A à l’extrémité 3’ OH Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase 4 (Source: "3. Modification des extrémités en présence de Taq polymérase ajoute un A à l’extrémité 3’ OH Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase 4")
Détail source à réviser : R. McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A Salle Jaune et Rouge TP2 4h30 TP3 4h30 TP5 6h00 Imprimer le poly et les fiches de comptes rendus Blouse et (Source: "R. McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A Salle Jaune et Rouge TP2 4h30 TP3 4h30 TP5 6h00 Imprimer le poly et les fiches de comptes rendus Blouse et marqueur 8 Connaissances acquises en ETG et indispensables à GGE ➢ Expression génétique : transcription, promoteur, ARN polymérase, ARNm...")
Détail source à réviser : Source : International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931 (Source: "Source : International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, Nature 409:860 et 2004, Nature 431:931")
Détail source à réviser : 1. Amplification par PCR de la séquence cible et addition de sites de restriction 2 (Source: "1. Amplification par PCR de la séquence cible et addition de sites de restriction 2")
Détail source à réviser : 3. Digestion du produit PCR par des enzymes de restriction 4 (Source: "3. Digestion du produit PCR par des enzymes de restriction 4")
Détail source à réviser : 2 - Clonage traditionnel 3 - Banque d’ADNc et banque génomique 4 - Clonage d’un ADN amplifié par PCR 10 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions Qu’est-ce que ça veut dir (Source: "2 - Clonage traditionnel 3 - Banque d’ADNc et banque génomique 4 - Clonage d’un ADN amplifié par PCR 10 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions Qu’est-ce que ça veut dire? 11 I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clo")
Détail source à réviser : ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 14 ➢ Comment (Source: "ARN, de protéines) in vitro ou in vivo (construction de nouvelles lignées cellulaires, d’OGM), biologie synthétique… I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 14 ➢ Comment? ADN exogène Vecteur ADN recombinant I - Construction d’une")
Détail source à réviser : 3 types de colonies sont possibles Très rare si la déphosphorylation du vecteur a été efficace Vecteur recombinantVecteur recombinant 1 bactérie transformée → 1 colonie 3 types de colonies sont possibles ? c LB agar + Am (Source: "3 types de colonies sont possibles Très rare si la déphosphorylation du vecteur a été efficace Vecteur recombinantVecteur recombinant 1 bactérie transformée → 1 colonie 3 types de colonies sont possibles ? c LB agar + Amp 2 - Clonage Traditionnel Exemple # 1 - Clonage d’un insert")
Détail source à réviser : CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC Insert 2000 bp EcoR I BamHI HindIII EcoRI Pst1 EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction (Source: "CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC Insert 2000 bp EcoR I BamHI HindIII EcoRI Pst1 EcoRI Bam HI 3000 pb 3 enzymes du site multiple de clonage 1 bp 500 bp 1000 bp 2000 bp ➢ Quelle(s) enzymes utiliser pour vérifier la construction ? ➢ Taille des fragments attendus après électrophorèse sur")
Détail source à réviser : 127 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification 128 Nested PCR suite 129 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR Trois stratégies sont possibles : ➢ clonage bouts francs ➢ TA cloning, ➢ clonage di (Source: "127 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 - Amplification 128 Nested PCR suite 129 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR Trois stratégies sont possibles : ➢ clonage bouts francs ➢ TA cloning, ➢ clonage directionnel en ajoutant des sites de restriction Les cinq étapes du clonage : ➢ Préparation insert suivant l’une des tro")
Détail source à réviser : Modifications des extrémités : Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase + ATP 4 (Source: "Modifications des extrémités : Phosphorylation des extrémités 5’, T4 Polynucleotide Kinase + ATP 4")
Détail source à réviser : coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC 11 mars - 45 min Programme : Cours I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (Source: "coli B : séquence bactérienne P: séquence du phage 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison 150 CC 11 mars - 45 min Programme : Cours I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) TD 1 – TD2 – TD3 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 9 - Clonage par recombinaison GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTXXXX...")
Détail source à réviser : Un morceau d’ADN est inséré dans 1 vecteur (plasmide, virus) ADN exogène Vecteur ADN recombinant 12 Vecteur : Support ADN dans lequel est inséré l’ADN exogène (Source: "Un morceau d’ADN est inséré dans 1 vecteur (plasmide, virus) ADN exogène Vecteur ADN recombinant 12 Vecteur : Support ADN dans lequel est inséré l’ADN exogène")
Détail source à réviser : Clonage moléculaire : 1 séquence d’ADN est intégrée dans un vecteur (= vecteur recombinant)… (Source: "Clonage moléculaire : 1 séquence d’ADN est intégrée dans un vecteur (= vecteur recombinant)…")
Détail source à réviser : Sous-clonage : 1 séquence d’ADN exogène est extraite d’un vecteur recombinant et transférée dans un nouveau vecteur (Source: "Sous-clonage : 1 séquence d’ADN exogène est extraite d’un vecteur recombinant et transférée dans un nouveau vecteur")
Détail source à réviser : I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 13 Pourquoi construire des molécules d’ADN recombinant (Source: "I - Construction d’une molécule d’ADN recombinant (clonage) 1 – Généralités et Définitions 13 Pourquoi construire des molécules d’ADN recombinant")
Détail source à réviser : Généralités et Définitions 18 Plasmides découverts fin des années 1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmide (Source: "Généralités et Définitions 18 Plasmides découverts fin des années 1940 : “pangene” or “cytogene” 1952 Joshua Lederberg = Plasmid 1973 Première publication, construction du premier plasmide recombinant : pSC101 Plasmide")
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Détail source à réviser : Masser, Michela Ciccarelli, Claes Andréasson, Hsf1 on a leash – controlling the heat shock response by chaperone titration,Experimental Cell Research,Volume 396, Issue 1, 2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment amplifi (Source: "Masser, Michela Ciccarelli, Claes Andréasson, Hsf1 on a leash – controlling the heat shock response by chaperone titration,Experimental Cell Research,Volume 396, Issue 1, 2020,112246 114 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 2 - Choix des amorces Ces séquences conservées permettent de choisir des amorces utilisables pour amplifier une séquence in...")
Détail source à réviser : Résultat PCR réussie PCR avec manque de spécificité de l’hybridation des amorces 126 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 – Amplification Touchdown PCR (utilisation d’un gradient de températures) Pour amélior (Source: "Résultat PCR réussie PCR avec manque de spécificité de l’hybridation des amorces 126 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 3 – Amplification Touchdown PCR (utilisation d’un gradient de températures) Pour améliorer la spécificité de l’amplification Y = 10 à 15 cycles (X=Th Tm-5°C)͌ Diminution d’1 degré par cycle jusqu’à Th (Tm - 5°C)͌ 4 - Clonage...")
Détail source à réviser : Purification Polynucléotide Kinase 130 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 4 - Clonage bouts francs 131 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 4 - Clonage bouts francs Préparation du vecteur : • digest (Source: "Purification Polynucléotide Kinase 130 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 4 - Clonage bouts francs 131 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 4 - Clonage bouts francs Préparation du vecteur : • digestion par une enzyme qui génère des extrémités franches • déphosphorylation des extrémités 5’P du vecteur puis inactivation de l’enzyme Sma...")
Détail source à réviser : Purification 132 133 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning Préparation du vecteur: • Digestion par une enzyme de restriction du MCS qui génère des bouts francs • Ajout des T en 3’OH + Taq polyméra (Source: "Purification 132 133 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 5 - TA cloning Préparation du vecteur: • Digestion par une enzyme de restriction du MCS qui génère des bouts francs • Ajout des T en 3’OH + Taq polymérase dTTP EcoRV SmaI 134 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel en ajoutant des sites de restriction Exemp...")
Détail source à réviser : Purification 137 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel en ajoutant des sites de restriction 138 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel en ajoutant des si (Source: "Purification 137 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel en ajoutant des sites de restriction 138 4 - Clonage d’un fragment amplifié par PCR 4 - 6 - Clonage directionnel en ajoutant des sites de restriction Not1 Fragment insérable dans un vecteur digéré par Nco1 et Not1 Fréquence Not1 = 1/65536 Fréquence Nco1 = 1/4096 139 4...")
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Détail source à réviser : sapiens 3060000 704589 46970 2818 94 Taille de la banque en fonction de la taille du génome et de la taille des inserts 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 (Source: "sapiens 3060000 704589 46970 2818 94 Taille de la banque en fonction de la taille du génome et de la taille des inserts 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 2 - Construction d’une banque d’ADN génomique 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d")
Détail source à réviser : Classe Longueur Nombre de copies dans le génome humain Fraction du génome humain (en %) $Gènes codant des protéines 0,5-2 200 kbp ͌ 19 000 40* (2,0)† Longs gènes d’ARN non codant 0,2-50 kbp ͌ 10 000͌ 15 (0,9) † Gènes ré _(Source: "Classe Longueur Nombre de copies dans le génome humain Fraction du génome humain (en %)$ Gènes codant des protéines 0,5-2 200 kbp ͌ 19 000 40* (2,0)† Longs gènes d’ARN non codant 0,2-50 kbp ͌ 10 000͌ 15 (0,9) † Gènes répétés en tandem ARNsn U2 ARNr 6,1 kb‡ 43 kb‡͌ 20͌ 300 <0")_
Détail source à réviser : Première Etape : purification des ARNm par chromatographie sur oligo dT Longueur 18 nt 85 Molécule à purifier + ARNm Molécule pour laquelle la molécule à purifier à un forte affinité, fixée sur une matrice insoluble + ol (Source: "Première Etape : purification des ARNm par chromatographie sur oligo dT Longueur 18 nt 85 Molécule à purifier + ARNm Molécule pour laquelle la molécule à purifier à un forte affinité, fixée sur une matrice insoluble + oligo dT Molécules éliminées par lavages 3 – Construction de banques génomiques ou d’ADNc 3 - 3 - Construction d’une banque d’ADNc Première")
Détail source à réviser : McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A Salle Jaune et Rouge TP2 4h30 TP3 4h30 TP5 6h00 Imprimer le poly et les fiches de comptes rendus Blouse et ma (Source: "McGehee OUVRAGE 7 TRAVAUX PRATIQUES TP 20 h 5 séances TP1 et TP4 : bio informatique 3h30 et 1h30 Bâtiment 32 A Salle Jaune et Rouge TP2 4h30 TP3 4h30 TP5 6h00 Imprimer le poly et les fiches de comptes rendus Blouse et marqueur 8 Connaissances acquises en ETG et indispensables à GGE ➢ Expression génétique : transcription, promoteur, ARN polymérase, ARNm, t...")
Détail source à réviser : ➢ Analyse bio informatique → séance TP 1 ➢ Méthode manuelle pour trouver des sites de restriction à 6 bp ACCTGATCGGTTACATGCTGATATCATTGCGATGCGTCATTGCCAGTCATTAAATGATCATATGC Ecriture sur un seul brin → GAT/ATC Eco R V 28 2 (Source: "➢ Analyse bio informatique → séance TP 1 ➢ Méthode manuelle pour trouver des sites de restriction à 6 bp ACCTGATCGGTTACATGCTGATATCATTGCGATGCGTCATTGCCAGTCATTAAATGATCATATGC Ecriture sur un seul brin → GAT/ATC Eco R V 28 2 - Clonage Traditionnel La même séquence palindromique peut être reconnue et coupée par des enzymes différentes Isoschizomères : enzymes d...")

📅 Repères chronologiques

Date	Événement
2000	Date de référence 1
2022	Date de référence 2
2004	Date de référence 3
1000	Date de référence 4
1034	Date de référence 5
1072	Date de référence 6},{

📊 Tableaux de Synthèse

Comparaison des vecteurs de clonage

Type de vecteur	Taille maximale d'insert	Exemples
Plasmide	Environ 10 kb	pUC, pBR322
Phage lambda	Environ 20 kb	λ phage
Cosmide	Environ 45 kb	Cosmide de P1
YAC (Yeast Artificial Chromosome)	Environ 1 Mb	YACs

⚠️ Pièges & Confusions Fréquentes

Confusion entre ADN recombinant et ADN génomique naturel.
Erreur dans la compréhension des principes de sélection des clones.
Mélanger les méthodes de transformation chimique et électroporation.
Confusion entre banques d'ADNc et banques génomiques.
Erreur dans la conception des amorces PCR, notamment la température de fusion.
Mauvaise interprétation des techniques de criblage par hybridation.
Confusion entre vecteurs adaptés à la taille des inserts.

✅ Checklist Examen

Comprendre la définition de l'ADN recombinant.
Savoir différencier les types de vecteurs selon la taille d'insert.
Maîtriser les étapes de construction d'une banque génomique.
Connaître les principes de purification des ARNm.
Savoir concevoir des amorces PCR efficaces.
Identifier les différentes méthodes de transformation bactérienne.
Comprendre le principe de criblage par hybridation.
Connaître les applications de la PCR dans le clonage.
Savoir réaliser une synthèse d'ADNc.
Maîtriser la production de protéines recombinantes.

📋 Plan du Cours

📖 1. Définitions et principes du clonage moléculaire et ADN recombinant

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 2. Caractéristiques et exemples des vecteurs de clonage plasmidiques traditionnels

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 3. Construction et criblage des banques génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 4. Purification des ARNm et synthèse d’ADNc pour banques d’ADNc

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 5. Insertion des ADNc dans vecteurs et méthodes de criblage associées

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 6. Organisation et répétitions dans le génome humain et implications pour le clonage

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 7. Types de vecteurs adaptés à la taille des inserts et taille des banques génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 8. Principes et protocoles d’amplification par PCR pour clonage

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 9. Paramètres et conception des amorces pour amplification PCR

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 10. Composition du milieu réactionnel et déroulement du protocole PCR

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 11. Autres domaines d’application de la PCR et techniques associées

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

📖 12. Production de protéines recombinantes

🔑 Notions clés & Définitions

📝 Points essentiels

💡 À retenir

🧩 Compléments de couverture

📅 Repères chronologiques

📊 Tableaux de Synthèse

⚠️ Pièges & Confusions Fréquentes

✅ Checklist Examen

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